盡管間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）移植為終末期肝病（ESLD）提供了一種替代策略，但由于細(xì)胞植入效率低，MSC治療的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用受到限制。提高細(xì)胞植入效率對(duì)于增強(qiáng)MSC對(duì)肝臟疾病的治療起著至關(guān)重要的作用。

近日，福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院在《Stem Cell Research& Therapy》發(fā)表了一篇關(guān)于干細(xì)胞移植治療終末期肝病的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)的綜述，該綜述還概述了復(fù)雜的細(xì)胞歸巢過程，并強(qiáng)調(diào)低細(xì)胞植入效率與MSC歸巢旅程所涉及的細(xì)胞外條件的巨大差異密切相關(guān)，這些條件包括體外恒定的受控條件到體內(nèi)可變的挑戰(zhàn)性條件。改善細(xì)胞存活和歸巢能力可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞植入功效。

因此，我們總結(jié)當(dāng)前的策略，包括低氧啟動(dòng)、藥物預(yù)處理、基因修飾和細(xì)胞因子預(yù)處理，以及脾切除和局部照射，用于提高M(jìn)SC的存活和歸巢能力，增強(qiáng)MSC治療的細(xì)胞植入和治療效率。我們希望這篇綜述能夠?yàn)樘岣唛g充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝臟疾病的效率提供新的見解。
介紹

終末期肝病（ESLD），包括失代償性肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌，死亡率很高，近年來發(fā)病率也有所上升。ESLD以肝功能嚴(yán)重異常為特征，包括肝功能失代償、門靜脈高壓、凝血功能障礙、黃疸、肝腎綜合征、肝性腦病和腹水。雖然肝移植能有效治療這些疾病，但由于供體器官短缺，大多數(shù)患者在等待移植手術(shù)時(shí)死亡。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種成人多能細(xì)胞，具有自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌功能。

最近的研究結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞移植可改善急性或慢性肝病患者的肝功能，為ESLD患者提供了延長生命的另一種策略。間充質(zhì)干細(xì)胞移植的治療功能主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

• 首先，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)分化或細(xì)胞融合替代肝細(xì)胞，促進(jìn)肝組織修復(fù)和再生。
• 第二，間充質(zhì)干細(xì)胞釋放生長因子和細(xì)胞因子，抑制肝細(xì)胞凋亡，刺激肝臟再生，從而發(fā)揮旁分泌功能。
• 第三，間充質(zhì)干細(xì)胞具有與適應(yīng)性和先天性免疫反應(yīng)相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)特性。

根據(jù)MSC治療的潛在治療機(jī)制，MSC的旁分泌或免疫調(diào)節(jié)作用取決于其在體內(nèi)的存活率，而MSC的肝分化或融合功能取決于到達(dá)受損肝組織的存活MSC的數(shù)量。因此，MSC植入效率與細(xì)胞存活或活力以及細(xì)胞向肝臟的充分遞送密切相關(guān)。事實(shí)上，郭等人發(fā)現(xiàn)移植后4周肝組織中MSC的存活率低于5%。我們前期的工作表明，小鼠纖維化肝臟移植后1天內(nèi)大量MSCs死亡，移植后11天存活的MSCs幾乎完全消失，表明MSC體內(nèi)存活率極低，導(dǎo)致肝病細(xì)胞移植效率不足。因此，細(xì)胞損耗已成為MSC治療肝病的主要瓶頸。需要提高細(xì)胞存活率和MSC歸巢能力以提高細(xì)胞植入效率，以最大限度地發(fā)揮間充質(zhì)干細(xì)胞移植在肝臟疾病中的治療潛力。

各種生物、生化和生物物理因素通過細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和體外和體內(nèi)生物活性因子之間的相互作用緊密影響MSC的存活和歸巢能力。體外和體內(nèi)條件的顯著不同嚴(yán)重影響移植后MSC的存活或活力。在MSC的體外擴(kuò)增過程中，包括氧分壓在內(nèi)的條件得到最佳控制，而MSC在體內(nèi)會(huì)遇到各種條件，包括缺氧和氧化應(yīng)激，這些條件會(huì)影響它們?cè)谝浦策^程中歸巢和有效重新填充肝組織的能力（圖1）。自導(dǎo)引過程的各個(gè)部分包括滾動(dòng)、激活、粘附、爬行和遷移（圖2)影響MSCs歸巢至肝實(shí)質(zhì)組織的數(shù)量。

MSC植入過程曲折，移植的MSC會(huì)經(jīng)歷從體外舒適生長條件到體內(nèi)惡劣環(huán)境（如缺氧、氧化應(yīng)激和炎癥）的劇烈變化，導(dǎo)致MSC治療肝臟的細(xì)胞存活率較低疾病。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療終末期肝病的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

MSC移植已廣泛用于臨床前研究，用于治療ESLD，包括肝衰竭和肝硬化，表明其在人類中治療ESLD的潛力。越來越多的臨床試驗(yàn)證實(shí)了MSC移植對(duì)ESLD的治療潛力，特別是失代償性肝硬化（DLC）和慢加急性肝衰竭（ACLF）（表1）。

ACLF，慢性肝衰竭急性發(fā)作；ADSC，脂肪來源的MSC；ALB，白蛋白；ALT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；α-SMA、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；AST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；BM-MSC，骨髓來源的MSC；CHE，膽堿酯酶；CI，中央靜脈注射；DLC，失代償性肝硬化；HBV，乙肝病毒；HCC，肝細(xì)胞癌；HCV，丙型肝炎病毒；IAI，肝動(dòng)脈注射；IL，白細(xì)胞介素；INR，國際標(biāo)準(zhǔn)化比率；ISI，脾內(nèi)注射；LC，肝硬化；LF，肝功能衰竭；LT，肝移植；MELD，終末期肝病模型；PBC，原發(fā)性膽汁性肝硬化；PC，凝血酶原濃度；PCNA，增殖細(xì)胞核抗原；PI，門靜脈注射；PVI，外周靜脈注射；PT，凝血酶原時(shí)間；Tbil，總膽紅素；TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1；腫瘤壞死因子-α, 腫瘤壞死因子α；UC-MSC，臍帶來源的 MSC

李等人發(fā)現(xiàn)在13至75個(gè)月的隨訪期間，人臍帶血來源的MSC治療顯著改善了3年（83.3%vs61.8%）和5年（63.9%vs43.6%）的總生存率對(duì)于DLC患者 (n=36)。

在一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)中，間充質(zhì)干細(xì)胞移植在DLC患者的13-75個(gè)月隨訪期間改善了總體生存率和肝功能生物標(biāo)志物（48周隨訪期間的白蛋白、凝血酶原活性、膽堿酯酶和總膽紅素）n=108)?。DLC患者接受MSC治療后，未觀察到明顯的副作用或細(xì)胞相關(guān)并發(fā)癥。

Lin等人進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)MSC治療可以通過改善ACLF患者的肝功能（總膽紅素和MELD評(píng)分）并降低嚴(yán)重感染的發(fā)生率（16.1%vs33.3%）來提高24周生存率（73.2%vs55.6%）（n=56）。

然而，穆罕默德內(nèi)賈德等人。發(fā)現(xiàn)在一項(xiàng)涉及肝硬化患者的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（n=27，隨訪12個(gè)月）中，MSC移植并沒有改善兒童評(píng)分、MELD評(píng)分、血清白蛋白、INR、血清轉(zhuǎn)氨酶或肝臟體積。鑒于世界范圍內(nèi)肝病的背景和指南并不完全統(tǒng)一，MSC治療肝病亞類的臨床獲益還需要開展一些大型、多中心、長期隨訪的臨床試驗(yàn)，以進(jìn)一步證實(shí)MSC治療的臨床獲益。

更重要的是，在解釋間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病的療效時(shí)，應(yīng)考慮細(xì)胞植入效率，包括間充質(zhì)干細(xì)胞靶向遞送至肝實(shí)質(zhì)組織的存活率和數(shù)量。?值得注意的是， Kantarc?o?lu等人在接受MSC治療6個(gè)月后對(duì)肝硬化患者 ( n=25)進(jìn)行了一系列肝臟活檢。發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞無法以足夠的量輸送到肝組織中。因此，細(xì)胞植入效率低嚴(yán)重影響MSC治療肝病的長期治療效果。接下來，我們將描述細(xì)胞歸巢過程以及如何提高細(xì)胞植入效率，以增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝病的治療功效。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植及體內(nèi)歸巢過程

根據(jù)之前的綜述，MSC歸巢可分為系統(tǒng)性和非系統(tǒng)性。對(duì)于非系統(tǒng)性歸巢，將間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射到目標(biāo)部位。在全身歸巢中，間充質(zhì)干細(xì)胞被注入血流，穿過循環(huán)系統(tǒng)，最后遷移到目標(biāo)部位。在肝臟疾病中，MSC歸巢是全身性的，因?yàn)镸SC移植通常是通過不同途徑（包括外周靜脈和肝門靜脈）進(jìn)行靜脈 (IV) 注射來實(shí)現(xiàn)。靜脈移植后，間充質(zhì)干細(xì)胞最初保留在肺部，然后輸送到肝臟、脾臟和腎臟。很少有間充質(zhì)干細(xì)胞位于其他器官。盡管輸送途徑影響間充質(zhì)干細(xì)胞到達(dá)損傷部位的行進(jìn)，但門靜脈和外周靜脈給藥之間能夠遷移到實(shí)質(zhì)肝組織的細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異。

此外，在急性肝衰竭或肝硬化模型中，外周靜脈和門靜脈給藥間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果沒有差異。考慮到MSC的存活和歸巢能力與MSC治療的療效密切相關(guān)，靜脈注射的MSC，無論注射部位如何，都會(huì)經(jīng)歷相似的體內(nèi)微環(huán)境和相同的全身歸巢過程。相關(guān)的，已經(jīng)證實(shí)靜脈注射后全身歸巢是不可避免的，并且涉及主動(dòng)或被動(dòng)的MSC外滲，然后是趨化因子引導(dǎo)的間質(zhì)向損傷部位遷移。與內(nèi)源性白細(xì)胞向炎癥部位遷移類似，全身施用的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)歷滾動(dòng)、激活、粘附、爬行和遷移（圖2）。

增強(qiáng)肝臟疾病中MSC存活和歸巢能力的策略

進(jìn)入血液后，間充質(zhì)干細(xì)胞將遇到一系列可能影響其生存的條件。支持體外生長的最佳恒定條件讓位于更多體內(nèi)惡劣、復(fù)雜的條件，包括低氧張力、流體壓力以及與全血成分的相互作用。

結(jié)果，許多間充質(zhì)干細(xì)胞在靜脈移植后在血液循環(huán)中死亡。此外，在曲折的歸巢過程之后，現(xiàn)有的存活MSCs繼續(xù)受到靶向部位的缺氧、氧化應(yīng)激和炎癥等挑戰(zhàn)性條件的影響，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)死亡，使得只有少量存活的MSCs在細(xì)胞內(nèi)生長。肝實(shí)質(zhì)組織。細(xì)胞損耗極大地降低了MSC移植在肝臟疾病中的理論功能?？紤]到細(xì)胞存活和細(xì)胞歸巢能力與MSC植入效率密切相關(guān)，有必要進(jìn)一步提高M(jìn)SC的存活和歸巢能力，最大限度地發(fā)揮MSC治療肝病的治療效果。接下來，我們總結(jié)了當(dāng)前增強(qiáng)MSC移植的細(xì)胞存活和歸巢能力的策略（圖3)。

目前的策略包括低氧啟動(dòng)、藥物預(yù)處理、基因修飾、細(xì)胞表面工程、細(xì)胞因子預(yù)處理、脾切除、納米顆粒標(biāo)記和局部照射，已被用于提高M(jìn)SC的存活和細(xì)胞歸巢能力。

提高間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)存活率的策略

缺氧啟動(dòng)：一般來說，人體動(dòng)脈血含12.3%O2，靜脈血含5.3%O2，肝組織含約4.04%O2（30.7mmHgO2）。與常氧培養(yǎng)的MSCs（NC-MSCs，約19.95%O2 ）的體外擴(kuò)增相比，體內(nèi)的氧溶解以及肝組織和循環(huán)系統(tǒng)中的氧含量極低。短期缺氧后，NC-MSCs由于Sug1上調(diào)和26S蛋白酶體失活而容易死亡，導(dǎo)致免疫原性增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，NC-MSC干性在體外廣泛擴(kuò)增過程中很容易丟失。

因此，NC-MSC的體內(nèi)擴(kuò)增很難適應(yīng)氧壓的劇烈變化。為了提高間充質(zhì)干細(xì)胞適應(yīng)氧氣變化的能力，低氧啟動(dòng)（一種體外預(yù)處理方法）已被用來提高其體內(nèi)存活率。缺氧啟動(dòng)可以增加MSCs分泌的自分泌或旁分泌因子，包括IL-6、TNFα、HGF、VEGF和前列腺素E合酶，從而促進(jìn)肝再生并減少肝細(xì)胞凋亡。此外，它還通過促進(jìn)自噬來預(yù)防MSC衰老，并下調(diào)p16、p53和p21。因此，低氧啟動(dòng)已被用來增強(qiáng)MSC治療肝病的效果（表2）。

藥物預(yù)處理：越來越多的證據(jù)表明，以活性氧過度產(chǎn)生為特征的氧化應(yīng)激是移植間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞存活率低的關(guān)鍵因素?？寡趸幬镆驯挥脕砜朔趸瘧?yīng)激并提高M(jìn)SC 的體外存活率（表3）。

事實(shí)上，我們的小組發(fā)現(xiàn)低劑量的還原型谷胱甘肽（GSH）和褪黑激素可用于保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞功能（包括細(xì)胞增殖和干細(xì)胞性）并減少長期體外傳代過程中的細(xì)胞衰老。重要的是，抗氧化劑預(yù)處理通過減少H2O2損傷模型中的細(xì)胞凋亡來增加MSC存活率并增強(qiáng)MSC治療肝纖維化的治療效果。使用其他抗氧化劑進(jìn)行預(yù)處理，包括依達(dá)拉奉、玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯和維生素E，也可用于增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率和肝衰竭的治療效果。

基因修飾：鑒于miR-210與缺氧或氧化應(yīng)激下的細(xì)胞存活密切相關(guān)，其過表達(dá)已被用來增強(qiáng)MSC在缺氧條件下的存活或H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而改善修復(fù)功能MSC移植?？沟蛲?、抗氧化或促生存基因的過度表達(dá)，包括BCL-2、Akt1、HGF、GATA-4和促紅細(xì)胞生成素 (EPO)，顯著增強(qiáng)MSC的體外和體內(nèi)存活率。此外，miR-34a的下調(diào)，而miR-16通過減少細(xì)胞凋亡來增強(qiáng)MSC的存活。因此，改變基因表達(dá)以減少細(xì)胞凋亡和/或提高對(duì)缺氧和氧化應(yīng)激的適應(yīng)性是增強(qiáng)MSC體內(nèi)存活的另一種方法。

增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)歸巢能力的策略

MSC體外修飾

基因修飾：MSC歸巢的整個(gè)過程是由配體和受體之間的串?dāng)_控制的。增加MSC上配體或受體的表達(dá)可提高其歸巢能力。過表達(dá)遷移相關(guān)基因，包括CXCR-4、CCR-2、CXCL-9和c-Met，已被用來增加MSC歸巢。基因修飾還顯著增強(qiáng)MSC對(duì)急性或慢性肝病的治療功效（表4）。

細(xì)胞表面工程：在細(xì)胞表面修飾目標(biāo)分子的細(xì)胞表面工程已被用來增強(qiáng) MSC 向目標(biāo)位點(diǎn)的遞送。此前，人類脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面采用脂質(zhì)偶聯(lián)肝素進(jìn)行改造，以增加間充質(zhì)干細(xì)胞的肝臟歸巢并改善間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性肝衰竭的治療。

細(xì)胞因子預(yù)處理：用細(xì)胞因子（包括IL-17和HGF）進(jìn)行預(yù)處理，可以改善MSC體內(nèi)的遷移和歸巢能力。

納米顆粒標(biāo)記：基于納米顆粒的成像已廣泛用于MSC生物分布的體內(nèi)評(píng)估。黃等人開發(fā)了一種用于MSC標(biāo)記的鐵基納米簇，發(fā)現(xiàn)它通過促進(jìn)CXCR-4表達(dá)來增強(qiáng)MSC遷移。

宿主環(huán)境調(diào)節(jié)

脾切除術(shù)：門脈高壓是肝硬化加重的典型身體狀況。此前，有人認(rèn)為流動(dòng)剪切應(yīng)力有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨、心血管、軟骨、脂肪和神經(jīng)分化。然而，高剪切應(yīng)力和門靜脈高壓阻礙了MSC的粘附和遷移。脾切除術(shù)是門脈高壓和肝硬化患者增加血小板計(jì)數(shù)和促進(jìn)肝再生的一種治療選擇。

瞬時(shí)局部照射：考慮到瞬時(shí)局部照射（TLR）會(huì)擾亂LSEC屏障并抑制Kupffer細(xì)胞的吞噬功能，因此TLR已被用于增強(qiáng)肝切除小鼠的肝細(xì)胞植入。

結(jié)論和未來方向

在此，我們回顧了間充質(zhì)干細(xì)胞移植的整個(gè)細(xì)胞歸巢過程以及間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝臟疾病的臨床現(xiàn)狀，強(qiáng)調(diào)細(xì)胞移植效率低是間充質(zhì)干細(xì)胞治療的使用和長期療效面臨的主要挑戰(zhàn)。

我們還強(qiáng)調(diào)，細(xì)胞存活和間充質(zhì)干細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)組織的遷移與間充質(zhì)干細(xì)胞的移植效率密切相關(guān)。因此，我們總結(jié)了目前提高間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病的細(xì)胞存活率和歸巢能力的策略。

目前的策略得到了體外和動(dòng)物研究的支持，但其在肝臟疾病中改善細(xì)胞存活和間充質(zhì)干細(xì)胞治療歸巢能力的臨床轉(zhuǎn)化潛力仍有待測(cè)試。或化學(xué)方法是提高間充質(zhì)干細(xì)胞植入效率的替代方法；然而，生物安全問題以及如何實(shí)現(xiàn)GMP級(jí)細(xì)胞生產(chǎn)還需要進(jìn)一步探索。

除了細(xì)胞存活率和歸巢能力，還有大量變量，包括來自不同組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的異質(zhì)性和患者的個(gè)體差異，這些都會(huì)影響細(xì)胞移植效率和間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝病的個(gè)性化。顯然，有必要開發(fā)個(gè)性化模型來解決間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病的療效問題。

參考資料：Yu, S., Yu, S., Liu, H. et al. Enhancing mesenchymal stem cell survival and homing capability to improve cell engraftment efficacy for liver diseases. Stem Cell Res Ther 14, 235 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03476-4

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