萬(wàn)字長(zhǎng)文！NK細(xì)胞療法的生物機(jī)制和臨床進(jìn)展

NK細(xì)胞作為一類無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的先天淋巴細(xì)胞，不少研究者和創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)已躬身入局推進(jìn)基于NK細(xì)胞的創(chuàng)新療法，特別是CAR-NK細(xì)胞療法；據(jù)Market Research Guru咨詢機(jī)構(gòu)的調(diào)研，全球NK細(xì)胞療法市場(chǎng)規(guī)模2021年達(dá)到3.40億美元，預(yù)計(jì)2028年將增長(zhǎng)至10.09億美元，年均復(fù)合增長(zhǎng)率（Compound Annual Growth Rate, CAGR）將達(dá)16.8%。

當(dāng)下NK細(xì)胞療法多數(shù)仍處于臨床前及臨床研究階段，雖然挑戰(zhàn)多多但卻充滿希望，本文以NK細(xì)胞療法為主題，觀今朝以望未來(lái)，以享諸君。

一、NK細(xì)胞及其生物學(xué)特征、功能和調(diào)控

（一）NK細(xì)胞概述

NK細(xì)胞是一種固有淋巴樣細(xì)胞（Innate Lymphoid Cell, ILP），是緊隨T細(xì)胞、B細(xì)胞之后的第三大類淋巴細(xì)胞；其形體較大，含有胞漿顆粒，通常采用“麻子臉”呈現(xiàn)NK細(xì)胞這種特征形態(tài)（圖1）。NK細(xì)胞是一個(gè)與生俱來(lái)的殺手，無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可快速反應(yīng)并非特異性產(chǎn)生殺傷效果，由此冠名“自然殺傷”。

NK細(xì)胞源自CD34+造血祖細(xì)胞（Hematopoietic Progenitor cells, HPCs），發(fā)育為淋巴樣祖細(xì)胞（Common Lymphoid Progenitor, CLP）后，逐漸下調(diào)CD34、上調(diào)CD56，進(jìn)而發(fā)育為NK細(xì)胞（圖2）。NK細(xì)胞主要存在于淋巴結(jié)、骨髓、外周血、肺、脾臟、肝臟等器官內(nèi)；根據(jù)CD56在細(xì)胞表面表達(dá)密度的多少，NK細(xì)胞包括CD56^bright和CD56^dim兩個(gè)亞群，其中CD56^dim NK細(xì)胞占體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量的90%以上（圖3）。

（二）NK細(xì)胞的表型及特征

基于細(xì)胞表面蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫分型是生物醫(yī)學(xué)研究中的常用方法，實(shí)踐中多采用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry），分型依據(jù)是免疫熒光檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)（采用“+/-”或“positive/negative”表示）以及相對(duì)強(qiáng)度（采用“+/++/+++”或“bright/moderate/dim/variable”表示）。對(duì)于NK細(xì)胞一般采用CD56（有的研究會(huì)同時(shí)采用CD56和CD16）進(jìn)行免疫分型，根據(jù)熒光亮度差異，將其分為CD56^bright和CD56^dim兩個(gè)亞群；進(jìn)一步的研究表明，CD56^bright亞群的細(xì)胞表面CD56高表達(dá)、CD16和殺傷細(xì)胞抑制受體（Killer-Cell Immunoglobulin-Like Receptors, KIRs）低表達(dá)，而CD56^dim亞群則反之，呈現(xiàn)CD56低表達(dá)、CD16和KIRs高表達(dá)的特征（圖4）。由于表型不同，NK細(xì)胞的CD56^bright和CD56^dim亞群具有不同的生物學(xué)功能。

CD56^bright NK細(xì)胞是未成熟的NK細(xì)胞，其生物學(xué)功能有兩方面，不僅是CD56^dim NK細(xì)胞的祖細(xì)胞，同時(shí)也是效應(yīng)細(xì)胞。CD56^bright NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較弱，主要依靠分泌細(xì)胞因子（Cytokines）、生長(zhǎng)因子（Growth Factor）、趨化因子（Chemokine）等發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，例如干擾素γ（Interferon-γ, IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、TNF-β、白細(xì)胞介素10（Interleukin-10, IL-10）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF）。CD56^dim NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力較弱，但是具備天然細(xì)胞毒作用和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC），具有更強(qiáng)的殺傷力。

（三）NK細(xì)胞的功能及調(diào)控

作為人體抗擊癌癥的第一道防線，NK細(xì)胞在防線中的作用主要包括（圖5）：

• （1）NK細(xì)胞分泌穿孔素（Perforin）、顆粒酶（Granzyme）、顆粒溶素（Granulysin）等具有細(xì)胞毒性的溶解性顆粒，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。
• （2）NK細(xì)胞表達(dá)TNF超家族成員結(jié)合相應(yīng)受體誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，例如FAS結(jié)合FAS配體（FAS Ligand, FASL），腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)受體（TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL）結(jié)合TRAIL受體（TRAIL Receptor, TRAILR）。
• （3）NK細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子（e.g. IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-10），生長(zhǎng)因子（e.g. GM-CSF）和趨化因子（e.g. CCL3、CCL4、CCL5、XCL1），招募巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等友軍協(xié)同抗戰(zhàn)。
• （4）表達(dá)Fc受體（CD16），介導(dǎo)ADCC效應(yīng)。

由于NK細(xì)胞缺乏特異性抗原識(shí)別受體，在防線中如何做到不誤傷“隊(duì)友”，其“防誤傷機(jī)制”與T細(xì)胞、B細(xì)胞不同。NK細(xì)胞功能的調(diào)控依賴于表面殺傷活化受體和殺傷抑制受體，兩者結(jié)合靶細(xì)胞相應(yīng)的表面配體后分別起到激活NK細(xì)胞殺傷與抑制NK細(xì)胞殺傷的作用（圖6）。

在正常生理情況下，兩個(gè)受體同時(shí)與正常細(xì)胞表面配體主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex, MHC）I類分子（MHC-I）結(jié)合，此時(shí)抑制信號(hào)占主導(dǎo)，NK細(xì)胞不殺傷正常細(xì)胞；在感染或腫瘤的病理情況下，MHC-I缺失或下調(diào)，非MHC-I異常表達(dá)或上調(diào)，此時(shí)抑制信號(hào)缺失，活化信號(hào)占主導(dǎo)，從而激活NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞（圖7）。形象地理解，NK細(xì)胞基于“有罪推論”：首先假定靶細(xì)胞有問(wèn)題，若靶細(xì)胞可以出示“良民身份證”，則將其判定為正常細(xì)胞，不予以殺傷；若靶細(xì)胞不能出示正確有效的證件，則將其判定為感染或腫瘤細(xì)胞，NK細(xì)胞便投入戰(zhàn)斗。

二、基于NK細(xì)胞的創(chuàng)新療法

（一）基于NK細(xì)胞的創(chuàng)新療法策略概述

NK細(xì)胞最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)七十年代，至今人們對(duì)其生理學(xué)機(jī)制及應(yīng)用仍在不斷探索。近年來(lái)腫瘤免疫療法、細(xì)胞療法、基因編輯等新技術(shù)不斷獲得突破，其中基于NK細(xì)胞的創(chuàng)新療法也顯現(xiàn)巨大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。根據(jù)設(shè)計(jì)思路的不同，基于NK細(xì)胞的創(chuàng)新療法分為激活殺傷活化受體和阻斷殺傷抑制受體兩條路徑，細(xì)分為五種策略（圖8）。

（1）細(xì)胞因子療法。向患者輸注IL-2、IL-15等細(xì)胞因子以激活體內(nèi)NK細(xì)胞活性。

（2）NK細(xì)胞的過(guò)繼性細(xì)胞療法（Adoptive Cell Therapy, ACT）。向患者輸注健康的經(jīng)活化的NK細(xì)胞，其中回輸?shù)腘K細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)IL-2、IL-15等細(xì)胞因子的活化處理。

（3）基因工程化NK細(xì)胞療法。向患者輸注基因改造的NK細(xì)胞，例如CAR修飾的NK細(xì)胞（CAR-NK）。

（4）單克隆抗體（Monoclonal Antibody, mAb）療法。根據(jù)抗體的靶向不同，可以分為兩類：i. 采用靶向腫瘤相關(guān)抗原的治療性抗體，例如靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）的西妥昔單抗（Cetuximab）、靶向CD20的利妥昔單抗（Rituximab），通過(guò)NK細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)達(dá)到治療目的；ii. 采用直接靶向NK細(xì)胞抑制受體的抗體，例如靶向NKG2A的莫那利珠單抗（Monalizumab），活化NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

（5）NK細(xì)胞銜接器（Engager）。銜接器一般是雙特異性抗體或三特異性抗體（e.g. 德國(guó)生物技術(shù)公司Affimed），可以同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞抗原以及NK細(xì)胞活化受體，將NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞“拉攏”在一起，進(jìn)而引發(fā)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)輸注有效物質(zhì)的屬性進(jìn)行分類，策略（1）、（4）和（5）歸為生物藥，策略（2）和（3）歸為細(xì)胞療法，本文以下內(nèi)容對(duì)NK細(xì)胞療法重點(diǎn)展開介紹。

（二）NK細(xì)胞療法

1. NK細(xì)胞療法技術(shù)流程及要點(diǎn)

NK細(xì)胞療法與其他免疫細(xì)胞療法的技術(shù)流程相似，概括起來(lái)主要包括三大環(huán)節(jié)（圖9）：獲得細(xì)胞、擴(kuò)增生產(chǎn)、臨床使用。

（1）獲得細(xì)胞

獲得細(xì)胞這個(gè)環(huán)節(jié)還涉及NK細(xì)胞來(lái)源、分離富集、活化、改造等若干步驟，本小節(jié)僅對(duì)NK細(xì)胞來(lái)源和CAR-NK細(xì)胞展開討論。

i. NK細(xì)胞來(lái)源

如何獲得合適的NK細(xì)胞是NK細(xì)胞療法的萬(wàn)里長(zhǎng)征第一步，目前主要來(lái)源于以下三類細(xì)胞，優(yōu)劣各有不同：

（i）原代NK細(xì)胞，主要通過(guò)采外周血（Peripheral Blood, PB）、臍帶血（Umbilical Cord Blood, UCB或CB）后分離獲得。外周血來(lái)源的NK細(xì)胞（PB-NKs）細(xì)胞具有安全性高、殺傷活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是細(xì)胞純度低且難以大量擴(kuò)增、低溫保存會(huì)影響細(xì)胞活性，給規(guī)?；a(chǎn)帶來(lái)較大挑戰(zhàn)；臍帶血來(lái)源的NK細(xì)胞（CB-NKs或UCB-NKs）可分化擴(kuò)增且獲得不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)（e.g. MD Anderson癌癥中心），但是缺點(diǎn)在于未完全分化、殺傷力有限、且有致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。

（ii）NK細(xì)胞系，NK細(xì)胞有許多成熟的細(xì)胞系，包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS、NKL等，目前臨床試驗(yàn)中主要采用NK-92細(xì)胞系，是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來(lái)的一株IL-2依賴型NK細(xì)胞株。NK-92細(xì)胞系相較于原代NK細(xì)胞最大的優(yōu)勢(shì)在于不涉及分選純化步驟、體外擴(kuò)增得到的細(xì)胞群體一致性更好、其表面的殺傷抑制受體表達(dá)很低從而具有更優(yōu)異的殺傷能力，但是NK-92細(xì)胞系的缺點(diǎn)也很明顯，主要表現(xiàn)在需要輻照處理、存在致瘤性以及體內(nèi)存活時(shí)間極短。

（iii）由干細(xì)胞定向分化所得的NK細(xì)胞，目前臨床試驗(yàn)中選用的干細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞（Human Embryonic Stem Cell, hESC）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC）。iPSC定向分化的NK細(xì)胞（iNKs）的研究熱度很高，是目前國(guó)內(nèi)外眾多公司主要采用的一個(gè)NK細(xì)胞來(lái)源。iNKs綜合了原代NK細(xì)胞和NK-92細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)，表型與原代NK細(xì)胞更為接近，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，有利于獲得充足且同質(zhì)的細(xì)胞，更容易滿足臨床應(yīng)用要求。不過(guò)iNKs技術(shù)難度較高，安全性和臨床有效性仍需面臨監(jiān)管挑戰(zhàn)；也存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，已有大量研究從表觀遺傳修飾、染色質(zhì)組織、代謝重編程等途徑來(lái)抑制其致癌潛能。另外，也有研究采用CD34+ HPC向NK細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方式獲得NK細(xì)胞。

ii. CAR-NK細(xì)胞

CAR-NK細(xì)胞需要在NK細(xì)胞基礎(chǔ)上“加裝”CAR（圖10），對(duì)于原代NK細(xì)胞、NK細(xì)胞系而言，僅需對(duì)其直接改造“加裝”CAR；對(duì)于源于干細(xì)胞定向分化的CAR-NK細(xì)胞，其技術(shù)路徑還可以分為兩種，一種是對(duì)干細(xì)胞改造“加裝”CAR，然后定向分化為可以表達(dá)CAR的NK細(xì)胞；另一種是干細(xì)胞先定向分化為NK細(xì)胞，然后再改造“加裝”CAR。

給NK“加裝”CAR的目的可以使得NK細(xì)胞具有靶向性，同時(shí)新建一條活化NK細(xì)胞的激活通路并增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于CAR-NK的治療功效至關(guān)重要。

CAR-NK借鑒傳承了CAR-T的基本結(jié)構(gòu)框架和轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，早期的CAR-NK構(gòu)建更多基于參與T細(xì)胞激活的共刺激域（Costimulatory Domain），現(xiàn)在人們?cè)絹?lái)越重視NK特異性信號(hào)轉(zhuǎn)接器，例如一些研究發(fā)現(xiàn)DAP10、DAP12和2B4發(fā)揮著特別重要的作用，這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)接器在與它們各自的上游受體結(jié)合后介導(dǎo)NK細(xì)胞活化。

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)（Gene Transduction）的穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CAR的前提。當(dāng)前常用的CAR-NK轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)包括病毒載體和非病毒載體兩類（圖11），其中常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus, AAV），常用的非病毒載體包括利用電穿孔（Electroporation）、睡美人轉(zhuǎn)座子（Sleeping Beauty Transposon）、脂質(zhì)體（Liposome）等方式轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA、mRNA。與CAR-T類似，CAR-NK的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)也面臨效率低的技術(shù)困境，開發(fā)具有更高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性的載體是CAR-NK未來(lái)走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

（2）擴(kuò)增生產(chǎn)

細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用時(shí)需要大量效應(yīng)細(xì)胞，有研究表明適合臨床應(yīng)用的NK細(xì)胞數(shù)量范圍在5×10⁶-1×10⁸ 細(xì)胞數(shù)量/體重（kg）。在獲得NK細(xì)胞（包含CAR-NK細(xì)胞）后，如何在體外高效擴(kuò)增成為產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化中需要面臨的又一挑戰(zhàn)，需要考察擴(kuò)增能力、適配NK/CAR-NK細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)、安全性、便捷性、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)成本等諸多因素，同時(shí)還要考慮生產(chǎn)工藝不能引致效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生非預(yù)期或異常的變化。

目前不同研究機(jī)構(gòu)或開發(fā)企業(yè)各自擁有不同的NK細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)培養(yǎng)工藝的特點(diǎn)，概括起來(lái)主要分為兩類（圖9）：

i. 滋養(yǎng)細(xì)胞（Feeder Cell）+細(xì)胞因子的培養(yǎng)工藝（Feeder-Dependent）

該類方法廣為采用的滋養(yǎng)細(xì)胞為K562細(xì)胞或經(jīng)基因改造的K562細(xì)胞，該細(xì)胞表面可以穩(wěn)定表達(dá)多種細(xì)胞因子受體，在多種細(xì)胞因子協(xié)同作用下，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞得到定向激活和擴(kuò)增。

該類培養(yǎng)工藝的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞擴(kuò)增活率高、速度快，CD56^bright NK細(xì)胞純度高，CD16等受體表達(dá)比例高，所收獲的NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷性。有研究報(bào)道，經(jīng)過(guò)這樣的培養(yǎng)方式可以收獲擴(kuò)增超過(guò)300倍的NK細(xì)胞。不過(guò)該方法引入的細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，其潛在風(fēng)險(xiǎn)難以完全消除；將正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，然后將收獲所得的NK細(xì)胞回輸體內(nèi)存在難以克服的倫理障礙；引入滋養(yǎng)細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞來(lái)源、歷史培養(yǎng)情況、安全性等方面需要建立管理標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控體系，進(jìn)一步增加了NK細(xì)胞產(chǎn)品的報(bào)批難度。

ii. 純因子培養(yǎng)工藝（Feeder-Free）

該類培養(yǎng)工藝使用IL-2、IL-12等細(xì)胞因子刺激，向NK細(xì)胞方向誘導(dǎo)或激活，同時(shí)配合相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，使NK細(xì)胞大量增殖。

該類培養(yǎng)工藝的優(yōu)點(diǎn)在于安全性，其所用的細(xì)胞因子在體內(nèi)原本就存在，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程相當(dāng)于在體外模擬體內(nèi)環(huán)境；由于無(wú)活細(xì)胞成分，較添加滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法而言，降低了產(chǎn)品報(bào)批難度。但是純因子培養(yǎng)技術(shù)的生產(chǎn)效率較低，在培養(yǎng)過(guò)程中需要消耗大量的細(xì)胞因子，細(xì)胞因子研發(fā)成本及價(jià)格都很高，所以導(dǎo)致該類工藝的生產(chǎn)成本居高不下；另外，該類工藝所收獲的NK細(xì)胞純度不及添加滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)工藝，存在脫靶效應(yīng)，殺傷效果偏弱。

在以上的分類基礎(chǔ)上，根據(jù)培養(yǎng)基是否含有血清和動(dòng)物源成分，可以作進(jìn)一步地細(xì)分。

（3）臨床使用

NK細(xì)胞產(chǎn)品的凍存（Cryopreservation）復(fù)蘇（Thaw）是回輸人體前的最后一個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，對(duì)該環(huán)節(jié)工藝的摸索是NK細(xì)胞產(chǎn)品走向大規(guī)模臨床應(yīng)用的必修課。有研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞對(duì)凍存復(fù)蘇極為敏感，復(fù)蘇后的NK細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒作用顯著降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)加入IL-2等細(xì)胞因子孵育后可以再次激活NK細(xì)胞功能（圖9）。

凍存復(fù)蘇環(huán)節(jié)一般遵循“慢凍快融”原則。慢凍可使細(xì)胞逐步脫水，以避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶；快融則是使凍存時(shí)產(chǎn)生的胞外冰晶迅速融化，避免其緩慢融化后進(jìn)入細(xì)胞再結(jié)晶而造成的損害（圖12）。在凍存環(huán)節(jié)，冰晶結(jié)構(gòu)與降溫速率密切相關(guān)，有研究結(jié)果表明1°C/分鐘或更慢的降溫速率對(duì)NK細(xì)胞是較為合適的；而在復(fù)蘇環(huán)節(jié)，合適的復(fù)蘇速率對(duì)最終回輸人體的NK細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要。

2. NK細(xì)胞療法的優(yōu)勢(shì)

T細(xì)胞療法是各類細(xì)胞療法中發(fā)展較為成熟的，從2017年開始美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）已經(jīng)陸續(xù)批準(zhǔn)了6款CAR-T與1款TCR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）也批準(zhǔn)了兩款CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品。T細(xì)胞療法給血液腫瘤患者帶來(lái)了痊愈的希望，但是脫靶效應(yīng)（Off-Target Effect）、細(xì)胞因子風(fēng)暴（Cytokine Storm; 也稱為細(xì)胞因子釋放綜合征, Cytokine Release Syndrome, CRS）、對(duì)實(shí)體瘤效果有限、治療費(fèi)用十分昂貴等缺陷，也制約了T細(xì)胞療法的應(yīng)用。

相對(duì)T細(xì)胞療法而言，NK細(xì)胞療法具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。

（1）更廣泛的細(xì)胞來(lái)源。與T細(xì)胞療法目前主要依賴患者自體T細(xì)胞不同的是，NK細(xì)胞療法可以采用多種不同來(lái)源的NK細(xì)胞。截至目前，進(jìn)入臨床階段的NK細(xì)胞療法的細(xì)胞來(lái)源主要包括外周血、臍帶血、NK-92細(xì)胞系、iPSC和hESC。

（2）更廣泛的適應(yīng)癥。NK細(xì)胞療法被廣泛用于各種癌癥治療，包括血液腫瘤（Hematological?Malignancy）和實(shí)體瘤（Solid?Tumor），其中CAR-NK療法有望突破CAR-T療法難以治療實(shí)體瘤的瓶頸。

（3）更多的殺傷途徑。NK細(xì)胞療法具有更多的腫瘤殺傷途徑，包括分泌穿孔素、顆粒酶，激活凋亡途徑以及介導(dǎo)ADCC。

（4）更好的安全性。異體NK細(xì)胞不會(huì)引起移植物抗宿主?。℅raft-versus-Host?Disease,?GvHD），供者NK細(xì)胞KIR與受者人白細(xì)胞抗原（Human?Leukocyte?Antigen,?HLA）不匹配而誘導(dǎo)的異體反應(yīng)（Alloreactivity）亦可改善腫瘤治療或干細(xì)胞移植的治療效果。對(duì)于CAR-NK細(xì)胞療法而言，其安全性主要體現(xiàn)在CAR-NK細(xì)胞不分泌炎癥因子（Inflammatory?Cytokines），一般不誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴；同時(shí)體內(nèi)存活周期短，不易產(chǎn)生長(zhǎng)期毒性。

（5）可作為通用（Universal）即用（Off-the-Shelf）產(chǎn)品。基于NK細(xì)胞的高安全性，NK細(xì)胞療法的一個(gè)巨大價(jià)值在于可作為通用即用產(chǎn)品，適用于不同個(gè)體、可長(zhǎng)期凍存，能為危重患者提供及時(shí)的治療，同時(shí)還能有效降低生產(chǎn)成本和終端售價(jià)，進(jìn)而降低患者自費(fèi)以及醫(yī)保支付壓力。

3. 注冊(cè)路徑分析

（1）目前的監(jiān)管情況

目前中國(guó)對(duì)于細(xì)胞治療采用“雙軌制”：一種軌道是將細(xì)胞療法產(chǎn)品作為藥品管理， NMPA及其下屬部門對(duì)臨床試驗(yàn)以及產(chǎn)品注冊(cè)進(jìn)行監(jiān)管審批；另一種軌道則是將細(xì)胞療法作為醫(yī)療技術(shù)管理，由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)（National Health Commision, NHC）及其下屬部門進(jìn)行監(jiān)管審批，準(zhǔn)予在醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)臨床技術(shù)應(yīng)用。

（2）監(jiān)管政策動(dòng)態(tài)

2019年3月，NHC發(fā)布了《體細(xì)胞治療臨床研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用管理辦法（試行）》征求意見稿，該辦法表明對(duì)體細(xì)胞臨床研究進(jìn)行備案管理，并允許臨床研究證明安全有效的項(xiàng)目經(jīng)過(guò)備案在相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)入轉(zhuǎn)化應(yīng)用。相比藥品注冊(cè)，醫(yī)療技術(shù)備案更為簡(jiǎn)單快捷，由此也吸引研發(fā)機(jī)構(gòu)與醫(yī)療機(jī)構(gòu)聯(lián)合開展研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn)（Investigator-Initiated Trial, IIT）。然而時(shí)至今日，該辦法仍未落地，意味著細(xì)胞治療通過(guò)第三類醫(yī)療技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用的路線暫未獲得官方支持。

2021年2月和12月，NMPA藥品審評(píng)中心（Center?for?Drug?Evaluation,?CDE）分別發(fā)布了《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》這兩部技術(shù)指導(dǎo)原則，分別對(duì)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品和基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品的開發(fā)做了規(guī)范。2021年2月，NHC在官網(wǎng)上發(fā)布了《對(duì)十三屆全國(guó)人大三次會(huì)議第4371號(hào)建議的答復(fù)》，答復(fù)函中明確提出：“我委一直鼓勵(lì)和支持干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等研究、轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等細(xì)胞制劑具有明顯的藥品屬性。國(guó)家藥品監(jiān)管部門已經(jīng)為相關(guān)制劑通過(guò)藥品審批制定配套政策，審批后可以迅速?gòu)V泛應(yīng)用，既有利于保障醫(yī)療質(zhì)量安全，又有利于產(chǎn)業(yè)化、高質(zhì)量發(fā)展?！?022年1月，NMPA發(fā)布《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄（征求意見稿）》和《嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療產(chǎn)品申報(bào)上市臨床風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃技術(shù)指導(dǎo)原則》兩項(xiàng)與細(xì)胞治療產(chǎn)品密切相關(guān)的法規(guī)。

基于以上一系列政策和意見的頒布，將細(xì)胞療法產(chǎn)品作為藥品管理“似乎”更契合我國(guó)監(jiān)管的發(fā)展方向，也許在未來(lái)可能從“雙軌制”變?yōu)橐运幤饭芾淼摹皢诬壷啤保c以美國(guó)、歐盟為代表的國(guó)際主流做法接軌。

（3）當(dāng)前NK細(xì)胞療法注冊(cè)的建議

NK細(xì)胞與T細(xì)胞均為免疫細(xì)胞，由此NK細(xì)胞療法可以模仿CAR-T的注冊(cè)路徑，按照新藥方式在國(guó)內(nèi)注冊(cè)申報(bào)。

2021年11月11日，CDE批準(zhǔn)了第一款我國(guó)自主研發(fā)的針對(duì)“晚期上皮性卵巢癌治療的靶向間皮素（Mesothelin，MSLN）嵌合抗原受體NK細(xì)胞（CAR-NK）注射液”的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)。通過(guò)眾多CAR-T與CAR-NK項(xiàng)目的審評(píng)審批，CDE專家在細(xì)胞治療領(lǐng)域也逐步積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，建議NK細(xì)胞療法的開發(fā)者與CDE保持緊密溝通，爭(zhēng)取獲得更多協(xié)助與指導(dǎo)。

三、NK細(xì)胞療法的臨床在研格局及融資進(jìn)展

目前海內(nèi)外已有多家科研機(jī)構(gòu)及初創(chuàng)企業(yè)布局NK細(xì)胞療法賽道，其中NK細(xì)胞ACT療法用于腫瘤治療的效果相對(duì)有限，而用于增強(qiáng)免疫力以及抗衰老方向的研究較多；相比之下，CAR-NK療法在腫瘤治療領(lǐng)域表現(xiàn)了更好的潛力，已有多家藥企的CAR-NK管線進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。以下我們主要針對(duì)CAR-NK療法的臨床在研格局與融資進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

（一）臨床在研格局

目前，MD Anderson癌癥中心（合作方Takeda武田制藥）與Fate Therapeutics（NASDAQ: FATE）公布了CAR-NK的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。

2020年2月，MD?Anderson癌癥中心在知名醫(yī)學(xué)期刊The?New?England?Journal?of?Medicine上公布了關(guān)于CAR-NK治療CD19陽(yáng)性淋巴瘤的I/II期臨床研究（NCT03056339）數(shù)據(jù)（圖13）。

臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)11例復(fù)發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin?Lymphoma,?NHL）患者和慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–hronic?Lymphocytic?Leukemia,?CLL）患者分別給予不同劑量的臍帶血HLA不匹配的抗CD19?CAR-NK細(xì)胞，大多數(shù)患者顯現(xiàn)出臨床療效，而且未觀察到重大毒性反應(yīng)。

參與該研究的11名患者中，有8名（73%）對(duì)治療有反應(yīng)，其中7名（4名NHL患者和3名CLL患者）達(dá)到了完全緩解，5名有反應(yīng)的患者緩解后繼續(xù)接受治療。治療反應(yīng)迅速，且注入的CAR-NK細(xì)胞擴(kuò)增并以低水平持續(xù)至少12個(gè)月。該療法安全性良好，受試者未出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性以及移植物抗宿主病，并且IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子與基線水平相比均未見升高。

該產(chǎn)品（編號(hào)TAK-007）已于2019年由MD Anderson癌癥中心與Takeda達(dá)成獨(dú)家許可和研究協(xié)議，Takeda于2021年11月啟動(dòng)了一項(xiàng)關(guān)鍵的II期開放標(biāo)簽多中心臨床研究（NCT05020015）來(lái)評(píng)價(jià)TAK-007在治療成人復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中的安全性和有效性。該試驗(yàn)將在全球范圍內(nèi)進(jìn)行，預(yù)計(jì)將招募約242名患者。

Fate Therapeutics是NK細(xì)胞療法的全球引領(lǐng)者，目前有多款NK細(xì)胞療法產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，F(xiàn)ate關(guān)于CAR-NK療法最新的臨床數(shù)據(jù)報(bào)道是在2021年12月美國(guó)血液學(xué)會(huì)（American Society of Hematology, ASH）年會(huì)上。Fate展示了針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤（B-Cell Lymphoma, BCL）患者FT596項(xiàng)目的臨床I期中期數(shù)據(jù)，F(xiàn)T596是該公司多抗原靶向、iPSC源性的CAR-NK候選產(chǎn)品。

摘要展示了截至2021年10月11日的臨床數(shù)據(jù)，包含了來(lái)自三個(gè)劑量隊(duì)列（分別為3000萬(wàn)、9000萬(wàn)和3億細(xì)胞）的25名可評(píng)估患者（單藥組n=12；聯(lián)合組n=13；聯(lián)合給藥利妥昔單抗），其中24名患者的療效也可評(píng)估（單藥治療組n=12；聯(lián)合治療組n=12），這25名患者的前期中位治療線數(shù)為四線。在ASH報(bào)告的數(shù)據(jù)截止日期之后，聯(lián)合組第三個(gè)單劑量隊(duì)列中的另一名患者出現(xiàn)了初始抗腫瘤反應(yīng)。

在共26名患者的單藥治療和聯(lián)合治療的高于9000萬(wàn)劑量隊(duì)列中，18名患者（69%）在第29天實(shí)現(xiàn)了客觀反應(yīng)，其中12名患者（46%）單劑量FT596后實(shí)現(xiàn)了完全緩解。其中9名之前接受過(guò)自體CD19靶向CAR-T細(xì)胞療法的患者中有6名在單劑量FT596治療后的第29天達(dá)到了客觀反應(yīng)（67%）。在總共包括12名患者的聯(lián)合組中，9名患者（75%）在單次給藥后的第29天實(shí)現(xiàn)了客觀緩解，其中包括7名患者（58%）實(shí)現(xiàn)了完全緩解。

FT596表現(xiàn)出良好的安全性，所有患者沒(méi)有觀察到免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（Immune Effector Cell–Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS）與GvHD，僅有3次細(xì)胞風(fēng)暴報(bào)告(均為一、二級(jí))。主要的不良反應(yīng)是中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、嘔吐、貧血、白細(xì)胞數(shù)減少、疲勞和血小板減少等，未觀察到B細(xì)胞或T細(xì)胞介導(dǎo)的排異反應(yīng)。

除了以上已公布的CAR-NK臨床結(jié)果以外，還有多家企業(yè)也在積極推進(jìn)，我們對(duì)目前已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段的代表企業(yè)和CAR-NK管線進(jìn)行了梳理（表1）。

GBM：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；AML：急性髓系白血??；MM：多發(fā)性骨髓瘤；MDS：骨髓增生異常綜合癥；BCL：B細(xì)胞淋巴瘤；CLL：慢性淋巴細(xì)胞白血??；ALL：急性淋巴細(xì)胞白血病；NSCLC：非小細(xì)胞肺癌；BCMA：B細(xì)胞成熟抗原。

數(shù)據(jù)來(lái)源：康橙投資

（二）重磅交易與融資進(jìn)展

MD Anderson癌癥研究中心與Fate Therapeutics臨床數(shù)據(jù)的公布，進(jìn)一步堅(jiān)定了大家開發(fā)CAR-NK產(chǎn)品的信心。CAR-NK在腫瘤治療領(lǐng)域的巨大潛力，獲得了科學(xué)界和資本市場(chǎng)的廣泛認(rèn)可，海外已有Fate Therapeutics、Century Therapeutics（NASDAQ: IPSC）、Caribou Biosciences（NASDAQ: CRBU）、Cytovia Therapeutics（NASDAQ: CYTX）等多家CAR-NK技術(shù)公司登陸納斯達(dá)克，此外多家跨國(guó)藥企也積極參與布局該賽道，達(dá)成了多筆重磅合作協(xié)議（表2）。

表2 CAR-NK領(lǐng)域重磅交易

2021年NMPA連續(xù)批準(zhǔn)了兩款CAR-T療法上市，大大鼓舞了國(guó)內(nèi)細(xì)胞治療企業(yè)。近兩年，國(guó)內(nèi)的CAR-NK療法開發(fā)呈現(xiàn)百舸爭(zhēng)流的景象，投融資進(jìn)展也十分活躍，多家初創(chuàng)Biotech公司都獲得大手筆的早期投資（表3）。

隨著資本的涌入，相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)工作得以進(jìn)一步提速，其中國(guó)健呈諾的CAR-NK產(chǎn)品已順利獲得IND批件，多家企業(yè)的產(chǎn)品也進(jìn)入IIT臨床研究階段。另有多家主要從事CAR-T療法開發(fā)的公司也有CAR-NK管線的布局如科濟(jì)生物（2171.HK）、恒潤(rùn)達(dá)生、博生吉等。加科思藥業(yè)（1167.HK）通過(guò)投資Hebecell，百濟(jì)神州（688235.SH）通過(guò)與Shoreline?Biosciences達(dá)成戰(zhàn)略合作也都快速實(shí)現(xiàn)在該領(lǐng)域的布局。

四、小結(jié)及展望

NK細(xì)胞療法作為細(xì)胞療法領(lǐng)域的一名老兵，隨著相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的突破和資本的大力加持，正在煥發(fā)“第二春”的路上高歌猛進(jìn)，特別是以Fate Therapeutics為代表的iPSC源NK療法逐步進(jìn)入主賽道，市場(chǎng)對(duì)NK療法的熱情也進(jìn)一步高漲，使得CAR-NK賽道成為了當(dāng)下國(guó)內(nèi)投融資市場(chǎng)的一個(gè)風(fēng)口。

人們往往傾向于高估一項(xiàng)新技術(shù)的短期效應(yīng)，而低估它的長(zhǎng)期影響。近幾年，隨著CAR-T與TCR-T為代表的T細(xì)胞療法的陸續(xù)獲批，細(xì)胞療法在腫瘤治療領(lǐng)域表現(xiàn)的“可能根治”的巨大潛力誘惑者諸多的從業(yè)者和資金向該領(lǐng)域涌進(jìn)，但是T細(xì)胞療法存在的CRS反應(yīng)、實(shí)體瘤療效欠佳、治療費(fèi)用昂貴等大大限制了其應(yīng)用。

NK細(xì)胞療法相比于T細(xì)胞療法在某些方面確實(shí)有著天然的優(yōu)勢(shì)，因而也成為了細(xì)胞治療領(lǐng)域的一根“救命稻草”，眾多細(xì)胞治療研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)都快速將目光向CAR-NK領(lǐng)域靠攏，當(dāng)然也包括多家從事T細(xì)胞療法開發(fā)的企業(yè)。

MD?Anderson癌癥中心與Fate?Therapeutics臨床數(shù)據(jù)的公布，對(duì)行業(yè)有很大的鼓舞，但是我們必須注意到這些都是小樣本的、短期的數(shù)據(jù)，大樣本、長(zhǎng)期的安全性和有效性結(jié)論才是決定成敗的關(guān)鍵，我們需要一直保持客觀謹(jǐn)慎的態(tài)度。

我們也需要注意到NK治療領(lǐng)域存在的眾多技術(shù)問(wèn)題，如NK細(xì)胞來(lái)源、NK細(xì)胞體外擴(kuò)增、凍融對(duì)NK細(xì)胞的損耗、NK細(xì)胞治療的持續(xù)時(shí)間、CAR-NK細(xì)胞中CAR的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，這些問(wèn)題都足以構(gòu)成NK療法發(fā)展的限速步驟或技術(shù)瓶頸，都需要投入大量的人力、資金和時(shí)間來(lái)解決。

同時(shí)對(duì)于從事NK細(xì)胞療法的國(guó)內(nèi)企業(yè)而言，在新冠疫情導(dǎo)致全球供應(yīng)鏈短缺的不確定形式下，對(duì)國(guó)產(chǎn)供應(yīng)鏈的重視必須提上戰(zhàn)略高度，尤其是影響產(chǎn)品工藝、報(bào)批和轉(zhuǎn)化的上游試劑耗材、生產(chǎn)純化設(shè)備和相關(guān)生命科學(xué)工具。

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