關(guān)節(jié)軟骨是人體眾多關(guān)節(jié)中常見的軟骨類型。然而，軟骨的再生能力有限。人們已經(jīng)采用了一系列方法來幫助45歲以下患有軟骨缺陷的成年人，但骨關(guān)節(jié)炎等其他軟骨病理僅限于非甾體抗炎藥和全關(guān)節(jié)置換術(shù)。

細胞療法和合成生物學不僅可用于治療軟骨缺陷，而且有潛力成為一種治療方法促進軟骨再生并可能逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎。細胞修復骨關(guān)節(jié)炎軟骨的潛力，以及利用合成生物學進行基因工程細胞干細胞方法，重點是自體軟骨細胞植入和基質(zhì)自體軟骨細胞植入。然后，我們將討論細胞療法。在這篇綜述中，我們將介紹當前細胞療法治療軟骨缺損再生的方法。

軟骨再生細胞療法

微骨折和嫁接：當前的黃金標準

微骨折 (MF) 也稱為骨髓刺激，用于小于2cm的軟骨缺損。在此過程中，軟骨下骨的一小部分被穿透，從而在骨髓和軟骨之間形成導管。在有缺陷的軟骨下方的骨頭上鉆一些小孔，以刺激骨髓，如所示圖1。骨髓中的干細胞有助于軟骨再生和缺損區(qū)域的愈合。 然而，MF更注重纖維軟骨的修復，而不是透明軟骨的實際再生。接受MF的患者在手術(shù)24個月后表現(xiàn)出關(guān)節(jié)功能下降。還有人擔心MF不會延遲OA的最終發(fā)病。

總體而言，MF 后軟骨的質(zhì)量和修復是可變且不一致的，這被認為與有限的低數(shù)量干細胞 細胞 在刺激后侵入受損區(qū)域。由于缺乏標準化和對患者的臨床隨訪，很難追蹤 MF 修復的成功率并比較不同的臨床結(jié)果。

圖1：FDA批準并實施的軟骨缺損再生療法示意圖總結(jié)。微骨折和自體移植等治療方法是當前軟骨缺損修復的黃金標準。 ACI和MACI已獲得FDA批準，可用于大面積缺損修復。

其他金標準治療方法包括使用骨軟骨移植修復較大（>2平方厘米）的病變。自體移植物是從關(guān)節(jié)中承載力較小的部位取出的骨軟骨組織，然后移植到病變部位。通過用健康組織對患者的缺損進行物理填充，希望該組織能與受損部位融合，從而修復缺損。

大量臨床研究表明，骨軟骨自體移植物對術(shù)后10年后的缺損修復有很好的療效，據(jù)報道，這種方法的優(yōu)點是移植物能迅速融入缺損部位。從生理學角度看，膝關(guān)節(jié)機械壓力最低的部位位于股骨外側(cè)蹄弓或股骨切跡處，也是大多數(shù)骨栓的來源部位。為了降低供體部位的發(fā)病率，人們采用了一種被稱為鑲嵌成形術(shù)的替代技術(shù)，即從部分健康軟骨組織中提取多個小的塞子，然后將其放置在中小型缺損部位。使用患者自身組織并進一步損傷膝關(guān)節(jié)的效果并不理想，因此有必要采用其他策略進行缺損修復。圖1：描述了目前修復軟骨缺損的治療方法。

自體移植物的其他替代方案是骨軟骨同種異體移植物，通常在死亡后24小時內(nèi)從年輕捐贈者身上采集，但保質(zhì)期較短，為28天，并且存在免疫原性問題。盡管如此，雖然這些治療方法已在臨床上取得成功，但組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域的目標是設(shè)計軟骨再生方法以克服這些限制。在過去的二十年里，人們對使用異種移植物修復骨軟骨缺損進行了更多的研究。這里，來自豬膝蓋等動物的骨軟骨栓經(jīng)過脫細胞處理，并在臨床前和臨床研究中顯示出功效，如圖2。

圖2.目前正在進行軟骨缺損再生臨床試驗的療法示意圖。植入式療法例如脫細胞支架和細胞片層技術(shù)被用于促進軟骨再生并填充缺損。此外，來自脂肪組織的MSC分泌組和基質(zhì)血管部分已被關(guān)節(jié)內(nèi)注射到膝蓋中，希望這些?細胞的分泌組能夠產(chǎn)生在治療效果上。還研究了脫細胞ECM與基質(zhì)血管成分相結(jié)合等治療方法的組合。

最近的研究使用分化的干細胞 細胞形成軟骨ECM，將其去細胞化并整合天然軟骨細胞進入脫細胞支架。人們注意到，與糖原合成酶激酶3β (GSK3β) 途徑相關(guān)的脫細胞基質(zhì)具有促軟骨形成作用，這對于調(diào)節(jié)細胞差異化。此外，這項研究證明了誘導多能干細胞，無論細胞來源如何，脫細胞ECM已成為用于軟骨組織工程的更普遍的天然基質(zhì)，并顯示出作為細胞的巨大潛力-免費治療性，也在圖2。在下一節(jié)中，我們將重點討論無支架和基于基質(zhì)軟骨細胞的軟骨修復療法。

軟骨細胞療法：聚焦自體軟骨細胞植入

在過去的二十年中，更多的研究涉及注射自體軟骨細胞以促進患者缺損處的軟骨再生。這稱為自體軟骨細胞植入（ACI）。ACI是一種解決軟骨缺陷（通常大于 2?cm）的兩步方法²。該程序的第一步是從膝蓋非承重部分的健康軟骨樣本中分離軟骨細胞。這些軟骨細胞隨后以單層形式擴增并注射回患者的缺損處。第一代技術(shù)使用骨膜補片將軟骨細胞懸浮液隔離到缺損區(qū)域。然而，軟骨細胞肥大、再手術(shù)和清創(chuàng)率高等問題使得第二代ACI成為必要。

新一代的補片材料從骨膜補片轉(zhuǎn)變?yōu)镮型和III型豬膠原膜。這種方法仍然需要對缺損處進行膜縫合，并導致一些懸浮液泄漏，但事實證明它確實更有效。

ACI后的組織成熟分為四個階段：植入階段（植入后0-6周）、過渡和增殖階段（6-12周）、早期階段成熟階段（12-26周）和晚熟階段（26周-3年）。在植入階段，軟骨細胞開始遷移到缺損處，然后在過渡和增殖階段填充缺損并形成軟軟骨。早期成熟被認為是軟骨細胞開始產(chǎn)生II型膠原和聚集蛋白聚糖從原始軟骨轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼒怨痰能浌堑臅r間點。最后，在成熟后期，新組織填充了缺損區(qū)域，軟骨達到透明狀態(tài)。

盡管設(shè)備存在一些局限性，但ACI是一種治療軟骨損傷的有效方法，并且具有通過使用患者自身細胞而缺乏免疫原性等優(yōu)點細胞。軟骨細胞滲漏和整體融入軟骨促進了進一步的改善。第三代 ACI 技術(shù)采用了稱為基質(zhì)輔助自體軟骨細胞植入 (MACI) 的基質(zhì)支架，增強軟骨細胞活力并模仿軟骨的機械特性。有關(guān)MACI的更多詳細信息將在下一節(jié)中討論。

軟骨細胞療法：基質(zhì)輔助自體軟骨細胞植入

MACI是目前最常見的治療軟骨缺損的細胞療法方法之一，已獲得批準2016年獲得FDA批準。從患者軟骨中分離軟骨細胞，進行擴增，然后接種到由豬膠原蛋白膜組成的3D基質(zhì)上。這種成熟的醫(yī)療設(shè)備結(jié)合了基質(zhì)和細胞，可增強軟骨再生以填充軟骨缺陷。

由于軟骨細胞在整個膝蓋中的可用性有限，因此該裝置背后的想法是促進軟骨細胞整合回天然軟骨，從而填補缺陷。 MACI適用于從單一到多重癥狀缺陷的一系列軟骨缺陷。膝關(guān)節(jié)常見的軟骨缺損包括：股骨外側(cè)髁、股骨內(nèi)側(cè)髁有或沒有骨損傷、髕骨和滑車缺損。

軟骨細胞療法：細胞片

組織工程學的進步改變了MACI等方法，也改變了細胞片技術(shù)等新方法。為形成細胞片，可在熱敏組織培養(yǎng)器皿上培養(yǎng)細胞，并通過降低培養(yǎng)溫度移除細胞。細胞片培養(yǎng)的常見方法包括將細胞片組合在一起。例如，高橋（Takahashi）等人將三張軟骨細胞片擴大并組合在一起，再培養(yǎng)7天，就形成了用于植入的分層細胞片。此外，關(guān)于腫瘤致病性的研究以及對基因突變和染色體異常出現(xiàn)的監(jiān)測，使細胞片技術(shù)得以在日本的臨床試驗中應(yīng)用。

在臨床方面，Sato等人進行的一項研究利用傳統(tǒng)手術(shù)干預治療膝關(guān)節(jié)OA，隨后進行自體軟骨細胞片移植以促進軟骨修復。該研究使用了八名患者的隊列，通過關(guān)節(jié)鏡活檢監(jiān)測術(shù)后12個月的治療效果。對患者活檢組織進行了組織學分析，并通過基因表達分析對細胞片進行了評估，以預測其臨床療效。圖像顯示，缺損區(qū)域的軟骨再生，膝關(guān)節(jié)排列保持一致。這項研究的結(jié)果支持了自體軟骨細胞片具有支持人體膝關(guān)節(jié)缺損部位透明樣軟骨再生的潛力這一觀點。

為了克服自體軟骨的局限性，利用干細胞來生成軟骨已變得越來越普遍軟骨細胞擴張。在下一節(jié)中，我們將進一步擴展不同的干細胞療法用于軟骨修復。

干細胞療法

干細胞是一種常見且豐富的細胞類型用于多種器官和病理的細胞療法。在本節(jié)中，我們將討論干細胞療法的用途軟骨缺陷并研究OA中的干細胞療法。

除患者自身骨髓來源的干細胞外，其他干細胞來源正在被研究作為一種細胞療法用于軟骨再生。值得注意的是，表格1描述了不同的細胞來源及其對軟骨再生的優(yōu)點和局限性。在本節(jié)中，我們將討論間充質(zhì)基質(zhì)細胞 (MSC)、MSC 分泌組和iPSC。

間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞可以很容易地來源于臍帶、骨髓、脂肪組織，并且具有自我更新和分化成多種組織的能力。更重要的是，間充質(zhì)干細胞具有分化為軟骨細胞和骨的多潛能，因此可用于軟骨和骨軟骨缺損。具體而言，骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）在與營養(yǎng)因子（如轉(zhuǎn)化生長因子-β3（TGF- β3））配伍后，顯示出關(guān)節(jié)軟骨再生的潛力。其他研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞在體外擴增過程中有助于軟骨細胞的表型維持，這表明間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞的共培養(yǎng)可能是自體軟骨細胞植入的一種新方法。

臨床研究顯示，在OA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細胞可改善軟骨狀況，且無嚴重影響。Muthu等人進行了一項薈萃分析，調(diào)查了目前文獻中的隨機對照試驗，以評估用于治療OA的間充質(zhì)干細胞的最有效范圍。由于臨床試驗缺乏標準化，干細胞治療骨關(guān)節(jié)炎的療效結(jié)果各不相同。建議進行劑量遞增臨床試驗，以更好地規(guī)范干細胞在治療OA中的應(yīng)用。

雖然間充質(zhì)干細胞具有作為軟骨再生細胞源的潛力，但它們也分泌細胞因子、趨化因子和細胞外囊泡等旁分泌因子，這些因子被認為也能促進愈合和再生。大量蛋白質(zhì)組學研究表明，間充質(zhì)干細胞分泌50-100納米的細胞外囊泡，即外泌體，可對受損組織產(chǎn)生治療作用。

張等人的一項研究分離了人胚胎間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體，每周對大鼠骨軟骨缺損進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。結(jié)果表明，外泌體治療12周后，與PBS對照組形成的纖維組織相比，缺損部位的軟骨和軟骨下骨完全恢復，并具有透明樣特征。

總的來說，這些研究表明MSC分泌組具有促進體內(nèi)軟骨再生的潛力體內(nèi)然而，在應(yīng)用于臨床之前，還需要開展更多工作來充分了解MSC分泌組促進再生的機制。

誘導多能干細胞

與胚胎干細胞的多能性相似，iPSCs也是由山中伸彌（Shinya Yamanaka）首先證明的經(jīng)過去分化過程的體細胞產(chǎn)生的。iPSCs的來源包括血液和成纖維細胞，其中分離出的細胞經(jīng)慢病毒改變后可表達常見的胚胎標志物，如八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）、SRY-box2（Sox2）、克魯珀類因子4（Klf4）和c-myc。如前所述，與間充質(zhì)干細胞的多能性相比，iPSCs具有多能性，這意味著iPSCs可以分化成任何主要生殖層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。這些細胞具有很高的自我更新潛能，使其成為透明軟骨的理想細胞來源。由于軟骨組織屬于中胚層，iPSCs可首先分化為間充質(zhì)祖細胞（iMPCs），然后再分化為軟骨。

中村（Nakamura）等人進行的一項研究使用了iPSC衍生的神經(jīng)嵴細胞，并將其誘導到類似間充質(zhì)干細胞的狀態(tài)。細胞分化后形成球體，用于生物打印。雖然這些方法尚未應(yīng)用于臨床，但人們正在利用iPSCs進行軟骨缺損再生的進一步研究。iPSCs可應(yīng)用于個性化醫(yī)療，因為它們可以來自患者本身，從而限制了免疫反應(yīng)。然而，在臨床應(yīng)用之前，必須了解iPSC分化為軟骨細胞的復雜性，以避免倫理問題。

了解OA和先前存在的關(guān)節(jié)疾病的多個方面對于基于患者的治療開發(fā)是必要的。此外，了解患者OA的原因，如機械關(guān)節(jié)衰竭、炎癥應(yīng)激和代謝應(yīng)激，可以為這些患者闡明最佳治療方法。對軟骨再生的再生級聯(lián)缺乏了解導致治療方法不一致，從而導致結(jié)果不一致。有人建議，為了減輕這些結(jié)果，未來的試驗應(yīng)該測試具體的假設(shè)，并重點關(guān)注對軟骨生物學和再生的機制理解，以便為治療的開發(fā)提供有價值的信息。

未來方向：合成生物學在軟骨再生方面的潛力

在癌癥等其他疾病狀態(tài)下，細胞已利用合成生物學積極改造以靶向特定受體。例如，嵌合抗原受體T細胞（CART 細胞）已被設(shè)計用于靶向腫瘤相關(guān)抗原受體。 就與OA相關(guān)的人口老齡化而言，存在i) 缺乏軟骨細胞再生潛力和ii) 稱為衰老的細胞周期停滯的常見發(fā)作，這會導致慢性低-通過衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的出現(xiàn)來確定炎癥的分級狀態(tài)。可以采用合成應(yīng)用來增加軟骨細胞的再生潛力，并通過合成遺傳網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建治療過程，本質(zhì)上是創(chuàng)建“工程軟骨細胞”，如圖3所示了。

圖3：用于軟骨修復的多種細胞療法。該示意圖描繪了多種細胞類型及其在軟骨缺損修復中的用途。在這里，我們從ACI和MACI中看到的自體軟骨細胞開始。然后我們轉(zhuǎn)向干細胞，主要是MSC和iPsc，它們可以分化為軟骨細胞并用于IA注射和基質(zhì)。細胞療法的未來主要集中在用于軟骨再生的合成工程軟骨細胞或干細胞衍生的軟骨細胞。

結(jié)論

在這篇綜述中，我們討論了目前軟骨再生的臨床方法，主要針對45歲以下的患者。自體軟骨細胞移植和基質(zhì)自體軟骨細胞移植已證明在軟骨缺損方面取得了成功，但適合該手術(shù)的患者范圍有限。此外，目前還沒有任何DMOAD獲得FDA批準，針對骨關(guān)節(jié)炎患者的干細胞療法仍處于早期臨床試驗階段。

了解先前存在的關(guān)節(jié)病理學的影響對于開發(fā)治療方法是必要的。 間充質(zhì)干細胞和誘導多能干細胞是軟骨再生的無限細胞來源，但也有其自身的局限性，例如成本、倫理和表型挑戰(zhàn)。采用合成生物學技術(shù)來增強軟骨再生可能有助于解決骨關(guān)節(jié)炎缺乏有前景的細胞療法的問題。

參考資料：Meagan J. Makarczyk (2023) Cell Therapy Approaches for Articular Cartilage Regeneration, Organogenesis, 19:1, DOI: 10.1080/15476278.2023.2278235

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