干細胞由于其自我更新和多能分化能力，為修復(fù)和替換受損組織和器官提供了新的治療途徑。在本文中，我們對各種類型干細胞的特征進行了系統(tǒng)回顧，并深入了解它們在細胞和無細胞療法中的潛在應(yīng)用。

此外，我們對干細胞治療的技術(shù)路線進行了全面的總結(jié)，并詳細討論了當前的挑戰(zhàn)，包括安全問題和分化控制。盡管仍然存在一些問題，但干細胞療法在再生醫(yī)學領(lǐng)域展示了巨大的潛力，并為管理更廣泛的疾病和創(chuàng)傷提供了新穎的策略和方法。

介紹

器官損傷和退行性疾病是由于衰老或功能喪失導(dǎo)致的細胞死亡引起的，會嚴重影響人們的生活。此類病癥的例子包括帕金森病、阿爾茨海默病、肝硬化和聽力損失等退行性疾病，以及心肌梗塞和皮膚燒傷等損傷性疾病。肝臟等器官具有較高的再生能力，在某些情況下可以充分再生以維持功能穩(wěn)定性。

小鼠肝臟已表現(xiàn)出強大的再生能力，可在部分肝切除術(shù)后支持肝功能。不幸的是，大多數(shù)組織和器官不具備這種再生能力，受傷后無法自我修復(fù)，最終導(dǎo)致功能喪失。一個例子是耳蝸中的毛細胞，一旦受損就無法再生，從而導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的聽力損失。這些患者將需要人工耳蝸，即通過手術(shù)將包含電極陣列和接收器的電子設(shè)備植入患者的內(nèi)耳，以直接刺激聽覺神經(jīng)并恢復(fù)患者的部分聽力。同樣，心臟瓣膜受損的患者需要更換由金屬或生物材料制成的人工瓣膜，以維持心臟功能（圖1） 。

人工器官替代很復(fù)雜，移植后患者可能會出現(xiàn)感染或免疫排斥。一些炎癥反應(yīng)，例如感染性心內(nèi)膜炎，可能是致命的。因此，需要一種免疫原性弱的治療方法，能夠有效修復(fù)患者受損的組織和器官，旨在最大限度地減少不良事件的發(fā)生。干細胞（SC）具有分化為多種細胞的巨大潛力，并且可以無限增殖。在移植到患者體內(nèi)以替換退化或壞死細胞之前，可以在體外誘導(dǎo)SC分化為特定細胞或組織類型。此外，干細胞可以分泌抗炎因子、細胞因子和外泌體來抑制炎癥反應(yīng)，改善受損區(qū)域的微環(huán)境，最終調(diào)節(jié)細胞增殖和分化。該綜述全面概述了干細胞治療的機制研究和臨床應(yīng)用，同時也指出了該領(lǐng)域的相關(guān)問題。

干細胞的分類

SC是具有多向分化潛力的細胞，同時保留自我復(fù)制和更新的能力?？筛鶕?jù)其分化能力的程度進行分類（表1）。

全能干細胞（TSC）是一種干細胞，具有分化為生物體內(nèi)任何細胞類型的卓越能力，包括胚胎發(fā)育所需的胎盤細胞。TSC存在于胚胎發(fā)育的最早階段，通常是在受精后的受精卵階段，此時精子細胞使卵細胞受精。此時，受精卵形成，具有發(fā)育成完整生物體的潛力。

TSC通常具有許多獨特的分子特征，包括較低的DNA甲基化和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒成分（ERV）的激活。TSC狀態(tài)可以通過多種方法誘導(dǎo)。GSK抑制劑1-azakenpaullone、視黃酸類似物TTNPB和激酶阻斷劑WS6的混合物可以誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞（ESC）在受精卵和二細胞階段表現(xiàn)出與TSC相似的表型。此外，異染色質(zhì)重塑也被證明有助于建立同種異型特異性的H3K4me3結(jié)構(gòu)域，從而有效促進ESC從多能性向同種異型的轉(zhuǎn)變。TSC分化為整個生物體的獨特能力引起了發(fā)育生物學和再生醫(yī)學研究的極大興趣。盡管如此，仍然存在與其使用和研究相關(guān)的特定倫理問題。

多能干細胞 (PSC) 以其在所有三個胚層（外胚層、內(nèi)胚層和中胚層）分化成各種特殊細胞類型的卓越能力而聞名。具體而言，PSC表現(xiàn)出分化為外胚層衍生物的顯著能力。它們產(chǎn)生神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)嵴細胞和源自外胚層的其他細胞類型的能力證明了這一點。它們通常源自囊胚階段的ESC，或通過使用四種轉(zhuǎn)錄因子對成體細胞進行重編程而獲得誘導(dǎo)多能干細胞 (iPSC)：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。

iPSC最顯著的優(yōu)勢在于它們源自分化的體細胞，提供了SC的優(yōu)勢，同時顯著避免了與TSC和ESC相關(guān)的倫理問題。培養(yǎng)中的 iPSC 具有無限的自我更新能力，可以產(chǎn)生幾乎無限量的特化細胞，為人類早期發(fā)育、疾病建模和再生療法的研究提供了巨大的潛力。

成體干細胞 (ASC) 被歸類為多能干細胞，與多能干細胞相比，其分化能力更受限制。這些細胞存在于全身的各種組織和器官中，在特定微環(huán)境中發(fā)揮維持、修復(fù)和再生組織的作用。與多能干細胞不同，多能干細胞具有從多個胚層分化成多種細胞類型的更廣泛潛力，而ASC的分化范圍受到更多限制。它們通常產(chǎn)生特定于其組織或起源器官的細胞類型，并且比多能干細胞更加特化。因此，ASC只能產(chǎn)生與其起源的確切組織相對應(yīng)的特定細胞譜系，這不同于其多能干細胞對應(yīng)物所表現(xiàn)出的更廣泛的分化潛力。

最常見的ASC包括造血干細胞（HSC；負責在骨髓中產(chǎn)生血細胞）、間充質(zhì)干細胞（MSC；在各種組織中分化為脂肪、軟骨和骨細胞） ）和神經(jīng)干細胞（NSC；分化為神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞）。ASC的特點是在成體組織中相對豐富、通過分泌特定信號分子調(diào)節(jié)微環(huán)境的能力以及易于分離。因此，它們對于組織器官修復(fù)和癌癥治療具有重要價值。

單能干細胞（USC）是干細胞中的一個特殊亞群，其分化潛力明顯受限。與能夠產(chǎn)生多種細胞類型的多能或多能干細胞相反，USC僅致力于產(chǎn)生單一特定細胞類型。這些細胞主要存在于特定的組織或器官中，在維持、修復(fù)和恢復(fù)它們所居住的特定組織方面發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。USC常見于成人組織中，能夠持續(xù)補充消耗的特定細胞群，在組織維護和修復(fù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。USC的例子包括皮膚中的基底細胞和骨骼肌中的衛(wèi)星細胞。USCs在疾病治療方面的潛力因其單一的分化模式而受到限制。

干細胞治療的技術(shù)路線

要使用干細胞進行治療，首先必須考慮干細胞的來源?？紤]到它們的分化能力和倫理問題，目前最廣泛用于治療的SC是PSC和ASC。ESC通常源自囊胚的內(nèi)細胞團。iPSC的產(chǎn)生如上所述，ASC來源于多種成體組織，包括脂肪組織、骨髓、神經(jīng)組織、血液、骨骼肌等，這提供了方便的細胞來源。

為了維持SCs的多代自我更新能力和分化能力，需要專門的培養(yǎng)系統(tǒng)來支持。培養(yǎng)基中不同的生物材料會影響SC的分化潛力和擴增能力。含有寡肽接枝水凝膠的培養(yǎng)基已被證明可以增強人類ESC和iPSC的增殖和多能性。使用含有人血漿和人胚胎提取物的培養(yǎng)系統(tǒng)可最大限度地提高傳代次數(shù)，同時保持iPSC的自我更新和分化潛力。此外，與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)系統(tǒng)可以更好地模擬干細胞體內(nèi)的微環(huán)境，增強不同干細胞物種的干性。例如，3D細胞培養(yǎng)物和天然腦組織提取物的結(jié)合可以加速SC分化為神經(jīng)元表型。

對于干細胞治療來說，最關(guān)鍵的步驟是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件和信號分子來引導(dǎo)SC向靶細胞類型分化。這可以通過模仿胚胎發(fā)育過程中的信號通路和微環(huán)境來實現(xiàn)。研究表明，內(nèi)耳發(fā)育與成纖維細胞生長因子（FGF）信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。刺激人類ESC中的這條通路可以誘導(dǎo)兩種類型的耳祖細胞分別分化為內(nèi)耳毛發(fā)樣細胞和聽覺神經(jīng)元。Wnt信號的輕度激活可促進MSC分化為軟骨形成細胞。

在納米材料復(fù)合材料表面培養(yǎng)細胞也會影響細胞的粘附和生長特性，從而通過細胞骨架結(jié)構(gòu)的變化觸發(fā)力轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的基因表達變化。通過這種方式，小鼠腎源性SC被誘導(dǎo)分化為足細胞或近端腎小管細胞。

通過上述方法的組合和優(yōu)化，可以實現(xiàn)SC的定向分化。在確保分化過程的有效性和穩(wěn)定性后，需要進行細胞鑒定和功能驗證，包括細胞表型分析、基因表達分析和功能評估，以確認分化后的細胞類型符合預(yù)期，從而確保所得細胞具有所需的屬性和功能。

最后，經(jīng)過分化和驗證的SC通過不同的載體和支架移植到患者體內(nèi)。在此階段，增強干細胞在組織中的保留對于治療效果至關(guān)重要。最常用的方式是將SC的鹽水懸浮液直接注射到目標器官或組織中。

綜上所述，完整的干細胞治療流程包括三個重要方面：干細胞的產(chǎn)生和擴增、靶向分化和應(yīng)用，以及針對不同臨床領(lǐng)域需要選擇最佳技術(shù)路線以實現(xiàn)受損組織器官的再生和功能恢復(fù)（圖2）。

干細胞療法的應(yīng)用

用于器官和組織再生的細胞療法包括一系列旨在通過將外源細胞引入體內(nèi)來修復(fù)或再生受損組織或器官的方法。除其他方法外，干細胞療法構(gòu)成了該領(lǐng)域的一個重要方面，利用特定細胞群的再生潛力來恢復(fù)從退行性疾病到損傷等各種情況下的組織功能。

器官和組織再生的細胞療法

基于細胞的療法通過多種機制發(fā)揮作用，包括細胞分化、生長因子和細胞因子等生物活性分子的分泌、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及組織修復(fù)和重塑的促進。退行性和損傷性疾病，包括循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有可能通過 SC 療法得到恢復(fù)。

第一個臨床應(yīng)用是在血液學領(lǐng)域，涉及從血液系統(tǒng)移植造血干細胞（HSC）。HSC移植現(xiàn)已成為血液惡性腫瘤和遺傳性血細胞疾病的護理標準。通過分析人類白細胞抗原 (HLA) 區(qū)域內(nèi)的基因，找到最佳HLA匹配的供體和受體，可以最大程度地減少移植物抗宿主病 (GVHD)。為了避免供體匹配的限制和潛在的免疫并發(fā)癥，對患者自身HSC進行基因校正或基因編輯極大地提高了血液疾病移植治療的效率。

Wiskott-Aldrich綜合征 (WAS) 的特征是巨血小板減少癥、濕疹、自身免疫和淋巴惡性腫瘤，是由WAS基因突變形式的表達引起的。通過慢病毒轉(zhuǎn)染正確的基因，然后將修飾的HSC輸注到患者體內(nèi)，患者自身的HSC中的這種突變已得到糾正，患者的免疫功能和臨床癥狀均得到改善。

在鐮狀細胞病中，通過γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體或直接靶向?qū)⑶虻鞍谆颍é?球蛋白、γ/β-球蛋白雜交體和抗鐮刀β-球蛋白）引入HSC，可逆轉(zhuǎn)血紅蛋白異常。胎兒γ-珠蛋白抑制基因BCL11A。

干細胞療法在治療耳聾方面也顯示出巨大的潛力。ESC與胰島素樣生長因子-1（IGF）、表皮生長因子（EGF）和bFGF聯(lián)合治療可以誘導(dǎo)ESC表達內(nèi)耳祖細胞標記物，包括ATOH1。Oshima等人將ESC/iPSC與來自胚胎雞卵囊的基質(zhì)細胞共培養(yǎng)。鑒定出一類具有短微絨毛的毛束細胞，其電生理特性類似于未成熟的毛細胞。該方法進一步完成了SCs向毛細胞的逐步分化。用SC治療遺傳性聽力損失還需要基因編輯的幫助。在患有MYO7A突變的耳聾患者中，需要對iPSC進行CRISPR/Cas9基因校正，以恢復(fù)分化的毛細胞樣細胞的正常形態(tài)和功能。

基于細胞的干細胞療法也逐漸完善，用于治療心臟和皮膚疾病。心肌細胞是完全分化的細胞，再生能力有限，決定了損傷后心臟功能不可逆的喪失。ESC和iPSC的心肌細胞的再分化有望進一步改善受損心臟組織的功能。隨著基因編輯的加入，SCs已被用于改善心臟疾病的治療，包括引入Akt1來增強心臟祖細胞的增殖，以及修飾SDF-1/CXCR4促進心臟SC募集的基因。在皮膚傷口愈合方面，SCs治療主要是減少愈合時間、傷口攣縮和疤痕形成的風險。

綜上所述，基于細胞的干細胞療法通過用正常干細胞分化產(chǎn)生的細胞直接替代受損組織來恢復(fù)組織功能，或者通過基因編輯糾正異常干細胞，從而恢復(fù)正常組織和器官功能。雖然展示了促進組織再生和逆轉(zhuǎn)特定病理狀況的潛力，但仍然存在一些挑戰(zhàn)，包括免疫排斥問題、倫理考慮以及移植后不受管制的細胞行為相關(guān)的風險。

無細胞旁分泌療法

越來越多的證據(jù)表明，除了直接細胞替代療法外，干細胞，特別是間充質(zhì)干細胞，還分泌蛋白質(zhì)、生長因子、細胞因子和趨化因子，對周圍細胞或微環(huán)境產(chǎn)生影響，以支持組織再生。這些分泌產(chǎn)物統(tǒng)稱為SC分泌組，能夠通過影響不同細胞類型（包括組織特異性細胞、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞和細胞外基質(zhì)中的成纖維細胞）的信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)受損組織的微環(huán)境。

由于其免疫調(diào)節(jié)特性，間充質(zhì)干細胞歸巢并遷移至損傷部位后，會產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)微環(huán)境中的免疫反應(yīng)。用于癌癥治療的免疫檢查點抑制劑，例如抗PD-1/PD-L1，也可誘發(fā)自身免疫1型糖尿病，而 MSC衍生的外泌體可顯著預(yù)防抗PD-1/PD-L1誘發(fā)的小鼠糖尿病。

SC還可以分泌促進微環(huán)境中血管生成的因子，同時它們自身分化成合適的細胞類型來替代受損細胞。胎兒皮膚就是這種情況，其中SC分泌組通過增強與胎兒皮膚再生和血管生成相關(guān)的靶基因（包括VEGF、Ang-1、Ang-2和PLGF ）的轉(zhuǎn)錄活性來促進HUVEC細胞增殖和血管生成。

綜上所述，SCs的旁分泌分泌物可以調(diào)節(jié)淋巴引流，促進血管生成，保證營養(yǎng)供應(yīng)，同時補充受損細胞。

除了正常微環(huán)境外，SCs還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）。源自MSC的富含MicroRNA-100 的外泌體可以通過mTOR/HIF-1α信號傳導(dǎo)抑制乳腺癌細胞中 VEGF 的表達，最終抑制TME中的血管生成。

總之，基于干細胞的無細胞療法顯示出巨大的前景，它們能夠調(diào)節(jié)組織微環(huán)境，從而比干細胞重新分化以補充受損細胞的細胞療法治療更多樣的疾病。與細胞療法相比，無細胞旁分泌療法具有多種優(yōu)勢，包括降低免疫排斥風險、簡化儲存和給藥過程以及潛在更少的安全問題（表2）。

當前的挑戰(zhàn)

在基于SC的療法快速發(fā)展的當前階段，重要的是不要忽視它們帶來的一些問題。

首先要考慮的問題是SC的來源，因為存在倫理和法律方面的考慮。ESC的使用受到倫理爭論和法律限制，而成人SC的獲取和放大在技術(shù)上很棘手，并且存在質(zhì)量控制問題。長時間連續(xù)培養(yǎng)引起的另一個問題是細胞活力喪失，導(dǎo)致增殖和分化能力降低。解決這個問題需要使用新材料，例如二氧化硅納米粒子，以干燥狀態(tài)長期保存干細胞。

其次，SCs分化的效率和方向是一個主要問題，因為這決定了治療的有效性。定向分化是一個我們尚未完全理解的復(fù)雜過程，細胞培養(yǎng)條件、細胞因子和信號通路等許多因素都會影響該過程。因此，仍需要更多的研究來更好地控制SC的分化方向和質(zhì)量，以預(yù)防腫瘤發(fā)生等不良事件。

干細胞治療的另一個關(guān)鍵決定因素是靶向細胞遷移的能力。在發(fā)揮其分化作用之前，干細胞必須有效地輸送到預(yù)定部位。目前，大多數(shù)干細胞治療方法采用靜脈內(nèi)藥物輸送，其在促進從血液循環(huán)到組織的靶向遷移方面效果有限。移植的干細胞的存活是干細胞治療面臨的另一個主要問題。SC療法的特點是MHC和HLA表達低，有可能降低免疫原性并顯著增強對移植物抗宿主反應(yīng)的抑制。然而，由于與SC治療相關(guān)的預(yù)擴張技術(shù)的局限性，其免疫特權(quán)逐漸受到損害。

輸注到人體后，體內(nèi)炎癥因子的存在進一步增強了干細胞的免疫原性，從而增加了排斥的風險。移植后的細胞存活和生長受到宿主免疫系統(tǒng)的影響，因為宿主對同種異體細胞的免疫反應(yīng)直接導(dǎo)致移植排斥。解決同種異體排斥的一種可能的解決方案是通過基因編輯敲除免疫相關(guān)基因，生成免疫相容的SC。需要進一步的研究來解決這些和其他挑戰(zhàn)，以成功地將干細胞療法轉(zhuǎn)化為臨床。

總結(jié)和觀點

自Ernst Haeckel于1868年首次發(fā)現(xiàn)干細胞以來，這些細胞的發(fā)育經(jīng)歷了幾個關(guān)鍵階段。最初，干細胞是從各種組織中分離和鑒定的，隨后iPSCs的開發(fā)以及基因編輯與SCs的結(jié)合，導(dǎo)致干細胞治療的逐步完善。由于干細胞的多向分化能力，其最直接的應(yīng)用是基于細胞的治療。這種方法涉及將SC（同種異體和轉(zhuǎn)基因自體SC）注射到疾病或損傷部位，以促進組織再生和功能恢復(fù)。

然而，干細胞療法也面臨許多安全問題。同種異體干細胞會觸發(fā)患者的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致移植物排斥，而移植的SCs過度增殖和分化可能導(dǎo)致腫瘤形成。因此，確保干細胞治療的安全性是一項重大挑戰(zhàn)。在干細胞治療中，確保干細胞能夠定向分化為靶細胞類型并保持其功能和穩(wěn)定性也至關(guān)重要。需要進一步的研究和改進的分化技術(shù)來確保分化的細胞具有所需的特性。

總之，作為再生醫(yī)學中重要的治療工具，干細胞療法在細胞本身及其分泌成分中以多種方式發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著對干細胞特性和功能的深入了解，預(yù)計更多的疾病和損傷將能夠從干細胞治療中受益。

參考資料：Wang J, Deng G, Wang S, Li S, Song P, Lin K, Xu X and He Z (2024) Enhancing regenerative medicine: the crucial role of stem cell therapy. Front. Neurosci. 18:1269577. doi: 10.3389/fnins.2024.1269577

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