間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因其獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)和再生特性，有望成為治療多種炎癥和自身免疫疾病的生物療法。培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞會分泌多種小分子、多肽、趨化因子、細(xì)胞因子和形態(tài)發(fā)生因子，統(tǒng)稱為分泌物。宿主免疫細(xì)胞與分泌物相互作用，調(diào)節(jié)組織損傷部位的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。除了具有免疫調(diào)節(jié)和再生能力外，其獨(dú)特的腫瘤 “歸宿 “特性使其成為攜帶抗癌藥物的理想候選者，可參與各種抗癌藥物的抗藥性（表1）。

1995年，Hillard Lazarus首次在臨床上探索MSCs作為細(xì)胞療法，以加速人類受試者的造血功能恢復(fù)。從那時起，多項(xiàng)臨床和臨床前研究一直在努力將MSCs確立為多種疾病的生物制藥。盡管MSCs研究隨著時間的推移不斷取得進(jìn)展，但大多數(shù)基于MSCs的試驗(yàn)仍處于I期或II期的早期階段，而只有少數(shù)（不到50個）處于III期，目前，全球只有12種產(chǎn)品（約1%）獲得上市許可。迄今為止，歐洲藥品管理局僅批準(zhǔn)了一種基于MSCs的產(chǎn)品作為治療肛周瘺的活細(xì)胞藥物，美國食品藥品管理局尚未批準(zhǔn)任何MSCs相關(guān)產(chǎn)品。

盡管臨床試驗(yàn)未能達(dá)到主要療效終點(diǎn)，但大量的臨床前動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在幾種小鼠疾病模型中的應(yīng)用效果良好。人體臨床試驗(yàn)中的細(xì)胞藥物變量是阻礙將間充質(zhì)干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為臨床結(jié)果的主要障礙。

優(yōu)化間充質(zhì)干細(xì)胞移植的常用劑量和給藥途徑：現(xiàn)狀和新前沿

因此，在這篇綜述中，我們打算探索間充質(zhì)干細(xì)胞在組織損傷后的當(dāng)前應(yīng)用。我們特別關(guān)注間充質(zhì)干細(xì)胞來源、移植途徑、代謝適應(yīng)性和細(xì)胞劑量。我們進(jìn)一步討論了優(yōu)化體內(nèi)植入的潛在方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞的組織來源

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞MSC可從多種器官和組織來源分離，例如骨髓、臍帶、脂肪組織、胎盤、外周血、牙周膜、羊水。來自不同來源的MSC擁有相似的多潛能分化能力，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。研究還確定了MSC向神經(jīng)元細(xì)胞的分化能力。然而，它們的分化效率在組織再生的特定譜系分化過程中會有所不同。因此，在成功的臨床試驗(yàn)中，選擇合適的組織來源對于生產(chǎn)臨床級MSC至關(guān)重要（圖1）。

間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性

與自體間充質(zhì)干細(xì)胞相比，現(xiàn)成的、低溫保存的異體間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中具有顯著的物流和成本優(yōu)勢。然而，要達(dá)到療效終點(diǎn)，臨床前的主要小鼠數(shù)據(jù)都支持使用合成間充質(zhì)干細(xì)胞。

由于間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)低水平的MHCI類分子，且缺乏MHCII類表達(dá)，因此間充質(zhì)干細(xì)胞以前被認(rèn)為是 “免疫特權(quán)”。此外，在早期的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)異體間充質(zhì)干細(xì)胞在體外混合白細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中能顯著延緩MHC不匹配淋巴細(xì)胞的增殖。因此，在臨床試驗(yàn)中，來自少數(shù)供體的大規(guī)模間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛用于治療一系列疾病，而無需擔(dān)心免疫排斥反應(yīng)。

事實(shí)上，在某些情況下，異基因間充質(zhì)干細(xì)胞可保護(hù)自身免受免疫檢測，通過短暫的 “打了就跑 “機(jī)制發(fā)揮治療活性。這在某些情況下是可能的，因?yàn)樵谶@些情況下，持續(xù)性是發(fā)揮治療效果所必需的。

集體證據(jù)表明，異體間充質(zhì)干細(xì)胞是用于急性組織損傷綜合征（如中風(fēng)、敗血癥或心肌梗塞）的唯一合理的策略。然而，在慢性退行性疾病中，由于需要長期反復(fù)輸注以維持間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果，因此更傾向于使用合成（自體）間充質(zhì)干細(xì)胞。

盡管異體間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫原性，但由于供體相關(guān)問題（患者年齡或疾病狀態(tài)）以及低成本即時護(hù)理的需要，臨床研究通常依賴于低溫保存的異體細(xì)胞。因此，避免同種異體排斥反應(yīng)和減輕移植休克的細(xì)胞修飾方法將有利于提高間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中的治療效用（圖1）。

間充質(zhì)干細(xì)胞移植常用給藥途徑的優(yōu)缺點(diǎn)

間充質(zhì)干細(xì)胞的給藥途徑是決定治療效果是否有效和安全的關(guān)鍵參數(shù)之一。盡管大量的臨床前和臨床試驗(yàn)都在嘗試優(yōu)化特定的給藥途徑（表2），但目前在人體臨床試驗(yàn)中還沒有就最佳的間充質(zhì)干細(xì)胞給藥方法達(dá)成共識。臨床試驗(yàn)通常選擇成本效益高且方便的靜脈輸注方法，盡管其治療效果參差不齊。根據(jù)治療要求，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過局部和全身給藥進(jìn)行植入。

01靜脈注射

優(yōu)點(diǎn)：此途徑是全身MSC輸送的主要方法。靜脈輸注被認(rèn)為是人體臨床試驗(yàn)中常規(guī)且安全的方法。根據(jù)最近對人體MSC臨床試驗(yàn)的調(diào)查，超過40%的研究為各種臨床疾病植入了中位數(shù)為1億個MSC。

缺點(diǎn)：盡管如此，許多報(bào)告發(fā)現(xiàn)靜脈輸注的MSC被困在肺部，隨后不久就會被清除。由于旁分泌功能支持MSC的治療活性，因此移植細(xì)胞壽命的縮短會削弱其治療活性。最近的一項(xiàng)小鼠臨床前研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)靜脈輸注最大耐受劑量（5000萬個細(xì)胞/公斤體重）的健康MSC未能影響結(jié)腸炎臨床結(jié)果。

02動脈注射

優(yōu)點(diǎn)：與靜脈注射相比，動脈內(nèi)（IA）注射方法更有效，因?yàn)樗鼫p少了肺中的細(xì)胞捕獲，并誘導(dǎo)目標(biāo)組織損傷部位的移植細(xì)胞遷移。

缺點(diǎn)：有趣的是，很少有研究發(fā)現(xiàn)IA輸送MSCs存在不良影響。盡管IA注射是有效將細(xì)胞靶向大腦的首選途徑，但最近的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，IA輸送MSCs治療中風(fēng)可能存在腦梗塞風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了最佳地使用IA方法，必須仔細(xì)考慮細(xì)胞大小、細(xì)胞劑量和輸注速度。

03腹膜內(nèi) (IP) 或皮下 (SC)

盡管腹膜內(nèi) (IP) 或皮下 (SC) 給藥在臨床試驗(yàn)中并不像靜脈注射那樣常用，但臨床前研究已證實(shí)它們在各種疾病康復(fù)中的治療作用。腹膜內(nèi) (IP) 或皮下 (SC) 給藥在陰道擴(kuò)張損傷大鼠模型中通過增加漏尿點(diǎn)壓力恢復(fù)尿道括約肌功能。

04局部注射

優(yōu)點(diǎn)：局部施用MSCs旨在增加治療細(xì)胞在目標(biāo)部位的植入，從而立即產(chǎn)生局部作用或分化為功能性細(xì)胞。MSCs的局部給藥方法已被確定為侵入性最小的方法，并且對于傷口愈合、燒傷或糖尿病相關(guān)傷口的皮膚移植存活以及修復(fù)實(shí)體器官及其相關(guān)組織（如心臟、大腦、脊髓組織、肝臟等）的損傷非常有效。

肌肉內(nèi)輸注 (IM) 與靜脈注射途徑一樣，也被認(rèn)為是MSCs輸送的微創(chuàng)和簡單途徑。此外，與其他傳統(tǒng)途徑相比，肌肉內(nèi)輸注途徑可延長植入MSCs的存活時間，這有助于改善治療效果。

缺點(diǎn)：MSCs局部注射雖然可以促進(jìn)治療效果的提高，但有時會造成創(chuàng)傷，其侵襲可能造成大出血和繼發(fā)性損傷。

綜合證據(jù)表明，每種遞送方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性。因此，應(yīng)根據(jù)研究目的、靶器官的大小和所用的動物模型來選擇細(xì)胞遞送途徑。

間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳時機(jī)/劑量/適應(yīng)性

時間：最佳細(xì)胞輸送時機(jī)對于最大限度地發(fā)揮MSCs的臨床效果至關(guān)重要，因?yàn)樗梢哉{(diào)節(jié)移植細(xì)胞的存活時間。

在任何成功的臨床試驗(yàn)之前，需要進(jìn)行比較研究以優(yōu)化組織或器官愈合過程的三個階段的MSCs輸送時間：即損傷期（幾小時）、修復(fù)期（幾天）和重塑期（幾周）。

心肌梗死急性損傷期的細(xì)胞毒性環(huán)境會降低移植MSCs的功能特性。而在修復(fù)期，即急性心肌梗死后4至7天輸送干細(xì)胞可顯示出最大的治療效果。

同樣，新生兒缺氧缺血性損傷后3天或10天進(jìn)行MSCs移植，運(yùn)動行為得到最大改善，但17天移植的治療效果明顯降低。

劑量：輸送的MSC數(shù)量是可以調(diào)整以實(shí)現(xiàn)最佳治療效果的重要因素。移植的間充質(zhì)干細(xì)胞的適當(dāng)數(shù)量取決于器官、組織和動物種類。例如，單次治療中大量細(xì)胞可能并不總是偏向積極的治療結(jié)果。靜脈內(nèi)移植的細(xì)胞劑量過高可能會導(dǎo)致肺部毛細(xì)血管堵塞，導(dǎo)致治療效果不佳。相反，根據(jù)http://clinicaltrials.gov/的報(bào)告，靜脈注射途徑具有最高的平均MSC劑量，將移植的細(xì)胞困在肺部可能是這種最高劑量的原因。

臨床試驗(yàn)確定的治療脊髓損傷患者的最佳劑量范圍是0.5×10⁶-5×10⁶MSCs/kg接受者體重。此外，在某些情況下，以一定間隔重復(fù)長期輸注似乎可以刺激產(chǎn)生積極的結(jié)果。盡管靜脈輸注MSCs是最安全的方式，但其主要缺點(diǎn)是輸送細(xì)胞的最大量受到限制，這與嚙齒動物模型不同。在嚙齒動物中，靜脈移植的最佳細(xì)胞濃度為50M/Kg，而在人類中，最佳劑量為1-2M/Kg體重。如果不同物種的功能生物機(jī)制相似且具有劑量依賴性，那么MSCs劑量的這種物種特異性差異將預(yù)示人類的結(jié)果會出現(xiàn)負(fù)面偏差。

適應(yīng)性：各種臨床前機(jī)制研究證實(shí)，MSC通過釋放多種旁分泌可溶性因子發(fā)揮局部和全身免疫抑制作用。由于代謝適應(yīng)性對旁分泌功能至關(guān)重要，因此主要的動物研究利用具有最佳代謝適應(yīng)性和高復(fù)制能力的培養(yǎng)挽救的對數(shù)期MSC。然而，人體臨床試驗(yàn)通常使用預(yù)先儲存的冷凍保存的同種異體MSC，立即解凍并在護(hù)理時注入。重要的是，在從冷凍保存中恢復(fù)后的前24小時內(nèi)，MSC表達(dá)不同的細(xì)胞損傷標(biāo)志物。

因此，集體證據(jù)表明，代謝適應(yīng)性是造成物種間結(jié)果差異的主要因素之一。制定減少細(xì)胞衰老或拯救MSC免受冷凍損傷的策略將改善MSC的臨床應(yīng)用。Chinnadurai等人證明IFNγ預(yù)許可刺激了衰老MSC中的多個免疫調(diào)節(jié)基因，并顯著改善了衰老MSC的免疫抑制作用。四大策略優(yōu)化間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床中發(fā)揮最大效用

MSCs分泌大量細(xì)胞因子、趨化因子，這些因子通過增強(qiáng)抗炎T調(diào)節(jié)細(xì)胞 (Treg) 功能、激活M2巨噬細(xì)胞極化和降低效應(yīng)淋巴細(xì)胞功能來減輕炎癥。MSCs還分泌促進(jìn)組織再生的形態(tài)發(fā)生素和外泌體。

MSCs因其具有自我再生、免疫調(diào)節(jié)和多能性、易于獲取、易于分離和培養(yǎng)擴(kuò)增等強(qiáng)大的內(nèi)在特性而受到廣泛歡迎。

人們已經(jīng)廣泛研究了基因改造或預(yù)處理方法，以提高M(jìn)SCs在體內(nèi)的持久性和治療效用。

01、免疫抑制特性

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的方法（如細(xì)胞因子預(yù)先許可或基因改造）可增強(qiáng)MSCs的免疫抑制作用。

用IL-1b預(yù)處理的MSC可產(chǎn)生更高水平的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，例如 TNF-a、IL-6、IL-8和IL-23A以及趨化因子，例如CCL5、CCL20、CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10和CXCL11。此外，IL1b預(yù)處理可提高M(jìn)SC在體外募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的能力。

02、細(xì)胞衰老和移植物存活

體內(nèi)移植后，宿主組織惡劣的微環(huán)境通常會導(dǎo)致MSC過早死亡或細(xì)胞衰老，進(jìn)而導(dǎo)致MSC功能下降。

據(jù)報(bào)道，過表達(dá)肝細(xì)胞生長因子 (HGF) 或缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF1A) 的 MSC也具有抗凋亡作用，因此對多種疾病的恢復(fù)具有很高的治療效果。

預(yù)防衰老是另一種MSC改造方法，可以阻止不可逆的細(xì)胞增殖并提高 MSC的治療功能。

IFN-γ刺激也被認(rèn)為是一種細(xì)胞凋亡預(yù)防方法，可在體外保護(hù)MSCs免受NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

03、延長異基因間充質(zhì)干細(xì)胞存活時間的策略

由于臨床前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的存續(xù)與治療效果之間存在直接關(guān)聯(lián)，因此預(yù)防同種異體排斥和延長MSC存續(xù)的方法將成為臨床研究中必不可少的工具。修改宿主或移植的MSC是避免同種異體MSC排斥的可能方法。將特定劑量的免疫抑制藥物與同種異體MSC一起使用是研究最充分的預(yù)防移植排斥的方法。

04、體外效力測定的重要性

高級臨床試驗(yàn)要求進(jìn)行MSC身份和效力測定，以衡量其治療效用。此功能測試可確保每個MSC制造批次的質(zhì)量或有效性，這些批次在細(xì)胞來源和制造工藝層面上各不相同。MSC會響應(yīng)體內(nèi)環(huán)境線索分泌多種免疫調(diào)節(jié)和再生分子。因此，開發(fā)測定矩陣方法的主要是確定對MSC在人體中再生功能至關(guān)重要的因素組合。

未來研究方向

成功的間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)依賴于間充質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)在功能，例如間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢特性、有效分化、增殖以及旁分泌或內(nèi)分泌影響的應(yīng)用。組織來源、代謝適應(yīng)性、劑量和輸送途徑是維持間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)在功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。

對于有效且安全的間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)，了解宿主免疫細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞衍生分泌體之間的串?dāng)_分子機(jī)制至關(guān)重要。

需要深入了解間充質(zhì)干細(xì)胞的作用機(jī)制和生物學(xué)特性，這些間充質(zhì)干細(xì)胞通過不同的制造工藝收集，以提高其治療效力。正確選擇最佳細(xì)胞輸送途徑、時間和劑量的知識對于提高間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率和整體功能至關(guān)重要。

此外，為了取得進(jìn)一步進(jìn)展，應(yīng)在目前缺乏有效治療的各種炎癥疾病模型中探索結(jié)合最佳輸送、劑量、預(yù)處理和追蹤的方法。應(yīng)重點(diǎn)開發(fā)不同的基因修飾策略，通過針對與年齡相關(guān)的信號通路、活性氧和自噬因子來增強(qiáng)老年間充質(zhì)干細(xì)胞的效果。

參考資料：Jayeeta Giri (2024) Optimizing Mesenchymal Stromal Cells Delivery: Present Status and New Frontiers in Regenerative Medicine. J Stem Cell Rep 6: 1-16

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