近期，國(guó)際期刊雜志“Stem Cell Research & Therapy”發(fā)表了一篇“干細(xì)胞療法治療1型糖尿病的現(xiàn)狀：評(píng)論與前瞻性思考”的文獻(xiàn)綜述。在這篇文章中，批判性評(píng)價(jià)僅限于關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)臨床試驗(yàn)。目的是找出在干細(xì)胞治療糖尿病變得可靠和可重復(fù)之前必須克服的局限性。作為細(xì)胞療法的替代方案，干細(xì)胞衍生細(xì)胞外囊泡(EVs)的使用被視為未來(lái)的一種可能性。

什么是1型糖尿病

糖尿?。―M）是一種代謝性疾病，是一個(gè)主要的健康問(wèn)題。1型糖尿?。═1DM）患者體內(nèi)胰島素分泌不足，而2型糖尿?。═2D）患者則無(wú)法利用胰島素。與1980年的1.08億人相比，2014年全球有超過(guò)4億人患有糖尿病。如果這一趨勢(shì)持續(xù)下去，預(yù)計(jì)到2045年，這一數(shù)字將增至6億多。其中，T1DM約占10%。

1型糖尿病的發(fā)病機(jī)制涉及自身免疫介導(dǎo)的對(duì)胰島中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的破壞。支持T1DM發(fā)病的自身免疫基礎(chǔ)的證據(jù)包括胰島周圍和胰島內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以及出現(xiàn)針對(duì)多種胰島自身抗原的自身抗體。隨著β細(xì)胞數(shù)量的減少，胰島素分泌也隨之減少，直到可用的胰島素不足以維持正常的血糖水平。外源性胰島素是治療T1DM患者的主要方法。雖然胰島素治療可以維持適當(dāng)?shù)难强刂?，但在許多患者中卻無(wú)法預(yù)防微血管并發(fā)癥。

此外，胰島素輸送不準(zhǔn)確會(huì)導(dǎo)致血糖控制不佳和/或低血糖。胰島移植可以有效治療T1DM患者。盡管效果良好，但胰島移植的主要問(wèn)題是需要免疫抑制和供體稀缺。另外，干細(xì)胞衍生的胰島素分泌細(xì)胞可以提供無(wú)限的供應(yīng)。

為此，胚胎細(xì)胞、新生兒細(xì)胞、誘導(dǎo)多能細(xì)胞和間質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞治療1型糖尿病的臨床應(yīng)用已有報(bào)道，并成為多篇系統(tǒng)綜述的主題。

多能干細(xì)胞與1型糖尿病

人類多能干細(xì)胞（hPSCs）包括胚胎干細(xì)胞（hESCs）和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）。胚胎干細(xì)胞（hESCs）來(lái)源于胚胎內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)，而人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）則是通過(guò)體細(xì)胞重編程產(chǎn)生的。然而，與hESCs相比，使用hiPSCs需要考慮的倫理問(wèn)題更少。此外，hiPSCs還提供了使用自體細(xì)胞的機(jī)會(huì)，因此可以避免異源免疫反應(yīng)。一些研究報(bào)道了hESCs和hiPSCs之間的一些差異。這些差異包括基因表達(dá)譜、DNA甲基化等表觀遺傳修飾和遺傳穩(wěn)定性。

人類多能干細(xì)胞分化產(chǎn)品的臨床移植

hESC衍生的IPC移植面臨兩大挑戰(zhàn)：免疫原性和致畸性。因此，這些細(xì)胞的移植需要將它們封裝在免疫隔離裝置內(nèi)和/或使用免疫抑制劑。為此，ViaCyte開(kāi)發(fā)了一種免疫保護(hù)裝置。該裝置裝載有源自hESC的PEC。數(shù)據(jù)表明，皮下移植這種組合[VC-01TM]可以控制嚙齒類動(dòng)物化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病。

完全分化的IPC由Vertex Pharmaceutical Incorporated（美國(guó)馬薩諸塞州波士頓）從同種異體多能干細(xì)胞開(kāi)發(fā)而來(lái)。在I/II期開(kāi)放標(biāo)簽臨床試驗(yàn)（NCT04786262）中，納入了兩名低血糖意識(shí)受損的1型糖尿病患者。IPC被移植到門(mén)戶系統(tǒng)中。還必須給予免疫抑制劑。

Vertex公布了第一名患者的早期令人印象深刻的數(shù)據(jù)。第270天，患者實(shí)現(xiàn)胰島素獨(dú)立，HbA1c水平為5.2%。第二位患者的結(jié)果則沒(méi)有那么好。到第150天，外源胰島素需求僅減少了30%，HbA1c變?yōu)?.1%。不過(guò)，結(jié)果尚未公布。目前，Vertex計(jì)劃再招募17名患者。這種治療的缺點(diǎn)是必須進(jìn)行免疫抑制。實(shí)際上，頻繁施用胰島素與使用免疫抑制劑之間存在權(quán)衡。

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間充質(zhì)干細(xì)胞治療1型糖尿病

間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮其治療作用。它們可以定位損傷部位并支持胰島的修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞還增強(qiáng)胰島移植物血管化。通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)功能，它們可以為早發(fā)T1DM提供治療手段。受這些有前景的特性的推動(dòng)，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)對(duì)MSC治療DM的用途進(jìn)行了評(píng)估。

• 胡等人將29名患者隨機(jī)分組如下：15名接受沃頓膠衍生間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈注射，14名接受常規(guī)治療并作為對(duì)照。作者報(bào)告稱，接受間充質(zhì)干細(xì)胞治療的患者的平均C肽水平有所增加，胰島素需求量有所下降。
• Carlsson及其同事在10名患者中使用了自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。研究人員報(bào)告稱，在1年的隨訪中，混合膳食耐受性測(cè)試中的C肽反應(yīng)有所增加。
• 在Araujo及其同事的一項(xiàng)試驗(yàn)中，13名患者被隨機(jī)分配如下：8名接受同種異體AT衍生的MSC和維生素D，5名作為對(duì)照。干預(yù)三個(gè)月后，MSC治療組的胰島素需求量和HbA1c水平較低。
• 伊扎迪等人用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療了11名患者。他們報(bào)告說(shuō)，早期診斷的T1DM中的間充質(zhì)干細(xì)胞治療改善了HbA1c和C肽水平。還觀察到促炎細(xì)胞因子向抗炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)變。
• 卡爾森等人使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療10名早發(fā)性T1DM患者。他們報(bào)告說(shuō)，治療組的胰島素需求量沒(méi)有變化，而對(duì)照組的胰島素需求量中位數(shù)增加了10單位/天。他和同事最近報(bào)告了對(duì)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行徹底系統(tǒng)回顧和薈萃分析的結(jié)果，這些試驗(yàn)測(cè)試了MSC在糖尿病患者中的臨床療效和安全性。

這些作者確定了176篇全文論文。然而，169項(xiàng)研究被排除在外，因?yàn)樗鼈兩婕胺侨祟悓?shí)驗(yàn)或沒(méi)有隨機(jī)化和對(duì)照。據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞輸注改善了HbA1c水平，但空腹血糖或C肽水平?jīng)]有顯著差異。盡管這些研究證明全身性間充質(zhì)干細(xì)胞給藥對(duì)于治療早發(fā)性1型糖尿病具有潛在益處，但仍存在大量不確定性，無(wú)法得出最終結(jié)論。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源不均勻，細(xì)胞劑量可變且患者數(shù)量有限。鑒于這些局限性，需要進(jìn)行大量高質(zhì)量、大規(guī)模隨機(jī)研究才能提供明確的結(jié)論。

為了利用其免疫調(diào)節(jié)功能，最近的一些報(bào)告將間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島聯(lián)合移植。王等人。從三名計(jì)劃接受胰島自體移植的慢性胰腺炎患者身上采集骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)門(mén)靜脈將胰島與間充質(zhì)干細(xì)胞共同移植。作者報(bào)告說(shuō)該過(guò)程是安全的。與對(duì)照組相比，患者的12個(gè)月空腹血糖水平較低，生活質(zhì)量較好。

干細(xì)胞療法治療1型糖尿病的挑戰(zhàn)和局限性

多能干細(xì)胞衍生的IPC面臨兩個(gè)重要問(wèn)題：異體免疫反應(yīng)及其腫瘤發(fā)生的可能性。

將其封裝在免疫隔離裝置中或使用免疫抑制是必要的。封裝有其固有的缺點(diǎn)。需要進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有的封裝系統(tǒng)。必須避免細(xì)胞缺氧，并確保有足夠的血管。還必須盡量減少異物組織反應(yīng)引起的囊周纖維化。如果這些問(wèn)題得不到解決，在封裝裝置內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞移植將很難取得令人滿意和有意義的結(jié)果。終生需要使用免疫抑制劑會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。此外，一些已使用的免疫抑制劑會(huì)導(dǎo)致糖尿病。表1概述了干細(xì)胞衍生的IPC。

最后，無(wú)論干細(xì)胞來(lái)源的IPC的來(lái)源如何，都必須解決其他問(wèn)題。必須量化實(shí)現(xiàn)胰島素獨(dú)立所需的細(xì)胞數(shù)量，并且還應(yīng)確定它們的功能壽命。

前景：間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體？

細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞（包括間充質(zhì)干細(xì)胞）自然釋放的膜囊泡。它們被包裹在脂質(zhì)雙分子層中，由于不含功能性細(xì)胞核，因此無(wú)法復(fù)制。大小在30-100nm范圍內(nèi)的EV被稱為外泌體（exosomes），該術(shù)語(yǔ)由Trams等人提出。外泌體是唯一一類已知由內(nèi)泌體通過(guò)內(nèi)泌體膜內(nèi)陷形成多泡體（MVBs）而衍生的EVs。外泌體通過(guò)多囊體與質(zhì)膜的融合釋放出來(lái)。

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眾所周知，外泌體是細(xì)胞物質(zhì)從分泌細(xì)胞到受體細(xì)胞的單向輸送器，可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能。這可以通過(guò)接觸信號(hào)、外泌體在靠近信號(hào)源的地方釋放或內(nèi)分泌信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)，外泌體隨后通過(guò)血液進(jìn)行系統(tǒng)運(yùn)輸，向遠(yuǎn)端發(fā)揮作用。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體已作為一種無(wú)細(xì)胞療法用于治療各種病癥。

間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體與糖尿病

作為細(xì)胞療法的替代方案，MSC衍生的外泌體在治療DM中的潛在作用已在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中得到探索。

He等人從人臍帶干細(xì)胞中制備外泌體。他們通過(guò)使用高脂肪飲食并隨后給予鏈脲佐菌素（STZ）在大鼠中建立了T2DM模型。通過(guò)尾靜脈靜脈注射外泌體，劑量為10mg/kg，溶于200μlPBS，每3天一次，持續(xù)2個(gè)月。施用外泌體或植入人MSC后血糖水平顯著降低。腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）和腹膜內(nèi)胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）顯示，外泌體給藥改善了葡萄糖代謝并增加了胰島素敏感性。此外，外泌體處理后自噬相關(guān)蛋白增加。作者認(rèn)為外泌體通過(guò)促進(jìn)自噬改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝。

EV作為細(xì)胞療法的替代品

關(guān)于利用EVs診斷和治療糖尿病或其并發(fā)癥的臨床前研究已成為多篇綜述的主題。

2014年，ClinicalTrials.gov僅發(fā)布了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT0213833）。自那以后，沒(méi)有公布或報(bào)告任何結(jié)果。

與此同時(shí)，干細(xì)胞療法的經(jīng)驗(yàn)很普遍，并在不斷優(yōu)化。然而，使用外泌體可避免細(xì)胞療法的幾個(gè)相關(guān)問(wèn)題，特別是壞死和免疫排斥反應(yīng)。由于外泌體沒(méi)有細(xì)胞核，因此不會(huì)致畸。外泌體可以儲(chǔ)存，并可作為現(xiàn)成的治療工具及時(shí)提供。外泌體通過(guò)靜脈注射給藥，無(wú)需侵入性程序即可重復(fù)使用。此外，外泌體具有自主靶向能力，可被設(shè)計(jì)為特定分子的載體。然而，由于缺乏制備或表征EVs的標(biāo)準(zhǔn)化方法，EVs的治療應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。此外，作為外泌體生產(chǎn)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是異質(zhì)性的。

因此，制備的樣本可能包含多種EV亞型的混合物。Witwer等人強(qiáng)調(diào)，有必要將國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出的鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)的建議（2018年更新）結(jié)合起來(lái)。通過(guò)這種方式，可以確定制備和表征EVs的框架。由于間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的EVs尚未實(shí)現(xiàn)全球標(biāo)準(zhǔn)化，因此應(yīng)使用可重復(fù)的檢測(cè)方法，通過(guò)物理、生化和功能屬性來(lái)定義最終產(chǎn)品。

總結(jié)

過(guò)去十年，干細(xì)胞治療糖尿病取得了重大進(jìn)展。然而，在可靠地利用細(xì)胞療法治療糖尿病之前，仍有一些障礙和挑戰(zhàn)需要克服。

我們的目標(biāo)是在沒(méi)有封裝、免疫抑制或基因操作的情況下成功進(jìn)行細(xì)胞移植。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，使用間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的IPC帶來(lái)了一線希望。與ESCs和iPSCs相比，間充質(zhì)干細(xì)胞的致畸風(fēng)險(xiǎn)微乎其微。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，異基因移植這些細(xì)胞不會(huì)引起免疫反應(yīng)，這可能是基于未分化群體的免疫調(diào)節(jié)功能。間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的IPC可進(jìn)一步增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，以克服T1DM患者的自身免疫反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的缺點(diǎn)是其異質(zhì)性，這取決于其獲取來(lái)源以及供體之間的差異。

目前正在嘗試將其標(biāo)準(zhǔn)化。皮下組織是細(xì)胞移植的最佳部位。但必須解決血管通透性差的問(wèn)題。目前，我們的實(shí)驗(yàn)室正在測(cè)試間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的IPC皮下移植模型。細(xì)胞被移植到纖維蛋白基質(zhì)中。此外，我們還同時(shí)移植了一個(gè)小型支架用于藥物輸送（圖1）。

細(xì)胞被移植到生物基質(zhì)內(nèi)。共同移植一個(gè)小支架用于藥物輸送。氧氣滿足即時(shí)需求，VEGF誘導(dǎo)早期血管形成，煙酰胺保持胰島活力，Exendin促進(jìn)體內(nèi)進(jìn)一步分化

外泌體是一種令人興奮的治療選擇。我們認(rèn)為，與源自未分化MSC的外泌體相比，源自IPC的受過(guò)改造的外泌體可能提供更好的治療效果。我們的實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行探索這一概念的實(shí)驗(yàn)（圖2）。

外泌體從幼稚MSC（未受改造的外泌體）或分化的IPC（受教育的外泌體）的條件培養(yǎng)基中回收，并靜脈注射到STZ糖尿病小鼠中。結(jié)果與腎被膜下細(xì)胞移植進(jìn)行比較

最后，必須強(qiáng)調(diào)的是，只有當(dāng)功能結(jié)果優(yōu)于新發(fā)現(xiàn)的藥物或不斷改進(jìn)的閉環(huán)胰島素泵時(shí)，細(xì)胞或外泌體療法對(duì)胰島素依賴型糖尿病患者才有意義且具有臨床合理性。

參考資料：Ghoneim, M.A., Gabr, M.M., El-Halawani, S.M. et al. Current status of stem cell therapy for type 1 diabetes: a critique and a prospective consideration. Stem Cell Res Ther 15, 23 (2024). https://doi.org/10.1186/s13287-024-03636-0

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