卵巢有兩個(gè)主要作用：女性生殖器官和激素分泌系統(tǒng)。

卵巢的功能是周期性的；在人類中，卵巢功能從30多歲開始隨著年齡的增長(zhǎng)而衰退，其擾亂更年期的內(nèi)分泌功能從50多歲開始。與體內(nèi)其他器官相比，卵巢功能衰退較早，這與卵巢絕經(jīng)的預(yù)測(cè)有關(guān)。與年齡相關(guān)的卵巢功能減退的機(jī)制是生殖醫(yī)學(xué)中的一個(gè)重要問題，該問題已研究了幾十年。

除了卵巢生殖功能的喪失，更年期也是衰老過程中不可避免的一部分，它會(huì)增加心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、血管運(yùn)動(dòng)癥狀、抑郁和認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致全身健康狀況的惡化。由于越來越多的女性計(jì)劃推遲生育，她們的預(yù)期壽命也在延長(zhǎng)，因此生殖衰老和更年期日益成為重要的健康問題。然而，盡管利用各種干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)已被應(yīng)用于維持卵巢儲(chǔ)備和延長(zhǎng)生殖潛能，但臨床適用的有效方案尚未確定。

從成人和胎兒組織中提取的間充質(zhì)祖細(xì)胞/間充質(zhì)干細(xì)胞（MPCs/MSCs）被認(rèn)為是治療包括生殖衰老在內(nèi)的各種疾病的新療法來源。MPCs可分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、存活和細(xì)胞增殖。然而，這些組織特異性MPCs的應(yīng)用仍存在一些缺陷，例如，采集MPCs需要進(jìn)行侵入性手術(shù)，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，而且由于供體的異質(zhì)性，MPCs的制造方案難以標(biāo)準(zhǔn)化。此外，MPCs在培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)能力有限，因此難以獲得足夠數(shù)量的MPCs供臨床使用。

最近，人胚胎干細(xì)胞衍生的MPC（hESC-MPC）由于其高增殖能力和易于標(biāo)準(zhǔn)化而被建議作為MPC的替代來源。盡管hESC-MPC有許多優(yōu)點(diǎn)，但如果未完全去除未分化的hESC，則存在發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。正在進(jìn)行許多研究來克服這個(gè)問題，我們的小組通過利用其高增殖能力從單個(gè)hESC-MPC克隆擴(kuò)增MPC，克服了這個(gè)問題。單細(xì)胞衍生的克隆擴(kuò)增hESC-MPC顯著增加了細(xì)胞數(shù)量，并且在畸胎瘤形成測(cè)定中是安全的。

我們之前的研究和許多其他研究已經(jīng)證明，MPC可以恢復(fù)卵巢早衰模型的功能和各種其他疾病。然而，在經(jīng)歷自然衰老的中年女性模型中，尚不清楚hESC-MPC是否有利于生殖力和卵巢儲(chǔ)存的長(zhǎng)期維持，或者它們的移植如何調(diào)節(jié)卵巢功能。

最近的一項(xiàng)研究重點(diǎn)是通過抑制mTOR來預(yù)防卵巢細(xì)胞的病理變化，從而推遲卵泡的激活和發(fā)育，延長(zhǎng)卵巢的卵泡儲(chǔ)備和內(nèi)分泌功能。此外，卵泡周圍間質(zhì)組織的卵巢纖維化是肥胖引起的卵巢功能障礙的關(guān)鍵因素，其過程與生殖衰老相似。事實(shí)上，減少誘導(dǎo)高水平炎癥、活性氧（ROS）、DNA損傷和細(xì)胞凋亡的不利因素可以改善卵泡質(zhì)量和卵巢壽命。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)多次移植人胚胎干細(xì)胞-間充質(zhì)祖細(xì)胞（hESC-MPC）可能通過抑制細(xì)胞凋亡和纖維化來保護(hù)圍絕經(jīng)期雌性小鼠的卵巢功能，并可能維持卵母細(xì)胞的能力并延緩生殖衰老。

目標(biāo)

目前，還沒有批準(zhǔn)的基于干細(xì)胞療法可以在衰老過程中保留卵巢功能。為了解決這個(gè)問題，我們開發(fā)了一種針對(duì)人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)祖細(xì)胞（hESC-MPC）的長(zhǎng)期治療方法。我們研究了這些細(xì)胞是否保留了抵抗卵巢衰老的能力，從而導(dǎo)致生殖衰老延遲。

材料和方法

在經(jīng)歷自然衰老的中年女性模型中，我們分析了hESC-MPC是否有利于生殖力和卵巢儲(chǔ)存的長(zhǎng)期維持，以及它們的移植如何調(diào)節(jié)卵巢功能。

結(jié)果

在多次導(dǎo)入hESC-MPCs后，對(duì)中年圍絕經(jīng)期小鼠的生殖周期進(jìn)行了分析，以評(píng)估這些細(xì)胞在延緩生殖衰老方面的潛在治療功能。細(xì)胞導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)在10個(gè)月（44周）的自然老齡小鼠中開始，這些小鼠的卵巢功能與人類圍絕經(jīng)期的卵巢功能相似。對(duì)14個(gè)月（60周）的小鼠進(jìn)行了生殖衰老評(píng)估，這些小鼠的卵巢功能與人類絕經(jīng)期的卵巢功能相似（圖1A和圖2A）。在主要實(shí)驗(yàn)之前，我們進(jìn)行了一項(xiàng)初步實(shí)驗(yàn)，以確定引入自然衰老小鼠模型的細(xì)胞的適當(dāng)數(shù)量（圖1）。

因此，我們預(yù)計(jì)多次使用hESC-MPCs會(huì)對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠的生育能力保持有更好的效果，因此在主要研究中選擇4°I.V組作為hESC-MPCs組（小鼠飼養(yǎng)至10月齡，然后每月靜脈注射一次hESC-MPCs，共注射4個(gè)月）。在相同時(shí)間內(nèi)靜脈注射生理鹽水（模擬對(duì)照）的小鼠作為對(duì)照組（圖2A）。檢查小鼠的發(fā)情周期（圖2B和C），包括4個(gè)階段：發(fā)情期（Pro）、發(fā)情期（Est）、發(fā)情期（Met）和絕經(jīng)期（Di），每 4-5天重復(fù)一次的Pro、Est、Met和Di周期被稱為 “規(guī)律發(fā)情周期”（圖2D）。

由于生殖衰老會(huì)增加發(fā)情周期的長(zhǎng)度和不規(guī)則性，我們?cè)u(píng)估了含有或不含hESC-MPCs的14月齡小鼠的發(fā)情周期。只有發(fā)情周期規(guī)律的10月齡小鼠才被納入主要研究。對(duì)照組中14個(gè)月大的小鼠發(fā)情周期規(guī)律性極低，而hESC-MPCs組中與年齡匹配的小鼠發(fā)情周期規(guī)律性相對(duì)較高（hESC-MPCs：24.7±2.7%vs對(duì)照組：3.1±3.1%，p<0.05）（圖2E），這表明hESC-MPCs延長(zhǎng)了小鼠的生殖力。

hESC-MPCs可維持圍絕經(jīng)期小鼠的卵巢結(jié)構(gòu)和功能

為了進(jìn)一步研究施用hESC-MPC是否能延緩卵巢儲(chǔ)備功能的衰竭，對(duì)卵巢進(jìn)行了組織學(xué)分析（圖3A）。結(jié)果表明，hESC-MPC治療甚至可以延緩圍絕經(jīng)期小鼠卵巢儲(chǔ)備的衰竭。

hESC-MPCs可改善圍絕經(jīng)期小鼠成熟卵子的排卵和胚胎發(fā)育情況

我們研究了hESC-MPCs是否能改善成熟卵子的排卵和胚胎發(fā)育，這兩者都會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。雖然三組小鼠的排卵比例沒有差異（圖4A），但與3個(gè)月大的小鼠（18.7±2.6；圖4B）相比，14個(gè)月大的兩組小鼠（14個(gè)月大對(duì)照組，3.6±0.1；hESC-MPCs組，4.6±0.3）每只小鼠的復(fù)蘇（排卵）卵子數(shù)都顯著減少。此外，囊胚形成率隨著年齡的增長(zhǎng)而降低（26.8±6.4）。相比之下，與14個(gè)月大的對(duì)照組相比，hESC-MPCs組的囊胚形成率（53.4±7.4）明顯提高，達(dá)到與年輕對(duì)照組相似的水平（48.7±6.8；圖4C和D）。

hESC-MPC挽救圍絕經(jīng)期小鼠的不良生殖結(jié)局

為了進(jìn)一步研究hESC-MPC對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠妊娠結(jié)局的治療功能，我們?cè)u(píng)估了兩組接受hESC-MPC治療后的生殖參數(shù)，包括交配率、分娩率、后代數(shù)量和窩產(chǎn)仔數(shù)。

兩組雌性小鼠均與年輕的成年雄性小鼠交配。圍絕經(jīng)期（14個(gè)月大）小鼠的所有參數(shù)值都明顯低于年輕對(duì)照組（3個(gè)月大）小鼠（所有數(shù)值如圖4所示）。相比之下，經(jīng)hESC-MPC處理的小鼠的交配率（圖4E）和分娩率（圖4F）與年輕對(duì)照組相似。雖然14個(gè)月大的對(duì)照組小鼠和經(jīng)hESC-MPC處理的小鼠的產(chǎn)仔數(shù)沒有明顯差異（圖4H），但hESC-MPC組每只雌性小鼠的平均后代數(shù)明顯高于對(duì)照組（圖4G）。這些結(jié)果表明，即使隨著年齡的增長(zhǎng)，hESC-MPCs也能部分維持生育能力。

hESC-MPCs可抑制圍絕經(jīng)期小鼠中與衰老相關(guān)的G-MDSCs增加和細(xì)胞炎癥

與衰老相關(guān)的慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致纖維化并降低器官功能。因此，我們檢測(cè)了卵巢中與炎癥和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平，以確定與衰老相關(guān)的卵巢纖維化是否與炎癥介導(dǎo)的反應(yīng)有關(guān)。如圖5A所示。

隨著年齡的增長(zhǎng)，人類和小鼠體內(nèi)的MDSC數(shù)量也會(huì)增加。免疫衰老也會(huì)影響老齡小鼠的MDSCs，而老齡小鼠的MDSCs會(huì)促進(jìn)炎癥和纖維化。因此，我們研究了將hESC-MPCs移植到老年小鼠體內(nèi)是否會(huì)影響B(tài)M中MDSCs的數(shù)量和頻率。結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，hESC-MPCs可抑制MDSCs的擴(kuò)增，并對(duì)衰老卵巢具有有益的抗炎和抗纖維化作用。

簡(jiǎn)述結(jié)果：與年齡匹配的對(duì)照組相比，多次引入hESC-MPC的圍絕經(jīng)期小鼠的原始卵泡和具有規(guī)則動(dòng)情周期的小鼠的數(shù)量有所增加。hESC-MPCs組的雌二醇水平恢復(fù)到年輕組和成年組的水平。hESC-MPC組的胚胎發(fā)育和活產(chǎn)率高于對(duì)照組，表明 hESC-MPC延遲了卵巢衰老。除了對(duì)卵巢的直接影響外，hESC-MPC的多次治療還可以通過抑制骨髓中產(chǎn)生的骨髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 來下調(diào)炎癥和纖維化相關(guān)基因，從而減少卵巢纖維化。

結(jié)論

多次引入人胚胎干細(xì)胞-間充質(zhì)祖細(xì)胞（hESC-MPC）可能是預(yù)防女性生殖衰老的有效方法，并且這些細(xì)胞是細(xì)胞療法的有前途的來源，干細(xì)胞治療可推遲圍絕經(jīng)期女性的卵巢衰老并保持生育能力。

參考資料：Shin EY, Jeong S, Lee JE, et al. Multiple treatments with human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitor cells preserved the fertility and ovarian function of perimenopausal mice undergoing natural aging. Stem Cell Research & Therapy. 2024 Mar;15(1):58. DOI: 10.1186/s13287-024-03684-6. PMID: 38433223; PMCID: PMC10910829.

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