人羊膜干細胞具有多能干性、有增殖性和抗炎特性，無致瘤性和免疫原性，是再生醫(yī)學和細胞治療臨床應用的理想種子細胞。
今天就為大家來科普下這位低調的“大腦守護神”，羊膜干細胞。
一、簡介
干細胞具有自我更新和分化潛力的雙重標志特征，可以來源于胚胎和成體組織。根據(jù)其發(fā)育潛能，干細胞分為多能干細胞（PSC）、專能干細胞和單能干細胞。PSC能夠形成具有不同功能特性的所有組織/細胞，這取決于衍生和培養(yǎng)條件。胚胎干細胞（ESC）和誘導多能干細胞（iPSC）是兩種最常見的PSC類型。
人羊膜干細胞(human Amniotic Epithelial Cells，hAECs)屬于胎盤組織，由受精卵發(fā)育至第8天的囊胚內細胞團分化形成，來源于外胚層。
人羊膜來源干細胞（hADSCs）包括人羊膜上皮干細胞（hAESCs）和人羊膜間充質干細胞（hAMSCs），與其他干細胞相比具有更新、多分化潛能、無致瘤性、低/無免疫原性，無倫理或法律問題，其強大的旁分泌作用，尤其是免疫調節(jié)作用，使它們成為用于各種疾病的細胞治療的有前途的干細胞來源。
二、人羊膜干細胞的特點
人羊膜來源干細胞相對于其他干細胞的優(yōu)勢
胎盤由羊膜、絨毛膜板、基底蛻膜、絨毛膜絨毛、子葉/間質和胎盤隔膜組成（圖1A）。在這些胎盤成分中，羊膜由于細胞數(shù)量較多，可作為細胞療法的合適原材料。羊膜是由上皮和間質組成的透明、光滑、無血管的單層薄膜（約100μm）。膜覆蓋胎兒并容納羊水。羊膜一般有上皮層、基底膜、致密層、成纖維細胞層和海綿層五層（圖1B）。
外胚層來源的hAMSC和下胚層來源的hAESC是羊膜中兩種主要的干細胞類型，負責產生細胞外基質 (ECM)、不同的細胞因子和生長因子。hAESCs來自羊膜最內層，直接與羊水和胎兒接觸，而hAMSCs則分散在羊膜內。hAESC和hAMSC的分離方案已被廣泛描述。
簡而言之，羊膜在37°C下用胰蛋白酶-EDTA處理45-60分鐘以釋放hAESCs 。然后，在旋轉器上用膠原酶IV在37°C下消化剩余的羊膜40分鐘以分離hAMSCs。
hADSC很容易分離并離體繁殖。hAMSC在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出成纖維細胞樣形態(tài)，而hAESC表現(xiàn)出鵝卵石樣形態(tài)。
與其他來源的干細胞相比，人羊膜來源干細胞具有以下優(yōu)點：
（1）獲取容易，來源豐富，無倫理道德爭議：羊膜作為胎兒出生后剩余的部分，可用于分離hAMSCs和hAESCs，不會損害捐贈者的利益；?
（2）無致瘤性：大量研究表明hADSCs體外在軟瓊脂上無增殖生長，體內植入NOD-SCID小鼠后無集落形成，無畸胎瘤形成；
（3）低免疫原性和高組織相容性：hADSC被認為是免疫豁免細胞，表現(xiàn)出低免疫原性的顯著特征。
人羊膜來源干細胞低表達主要組織相容性I類抗原 (HLA-ABC)，不表達主要組織相容性II類抗原 (HLA-DR) 和β2微球蛋白，重要的是，細胞不表達不表達HLA-ABC共刺激分子，例如CD80、CD86和CD40。有報道將hAMSCs移植入人體治療溶酶體疾病，未見明顯排斥反應。最近的一項研究還表明，靜脈注射hAESC不會導致溶血、過敏反應、毒性或腫瘤形成。
阿克勒等人報道稱，免疫型不匹配的人羊膜在移植到志愿者皮膚下時不會引起宿主免疫反應。然而，一些研究強調，人類羊膜細胞實際上可能并不被認為具有免疫特權，但相反，可以刺激先天性和適應性免疫反應，這表明羊膜干細胞可能具有協(xié)同免疫刺激作用。
人羊膜來源干細胞的高多能性
當暴露于外源生長因子或化學物質時，hADSC有可能分化成所有三個胚層。hAMSCs和hAESCs均表達胚胎干細胞的典型表面標志物，如SSEA-3、SSEA-4、SOX-2、TRA1-60和TRA1-81，特別是Oct-4和Nanog，表明hAMSCs和hAESCs在再生醫(yī)學中的巨大潛力。迄今為止，研究表明hADSC能夠分化為脂肪細胞、骨細胞、神經細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、造血細胞、內皮細胞、腎細胞和視網(wǎng)膜細胞（圖2）。
hADSC的免疫抑制和免疫調節(jié)作用
hAMSCs衍生的可溶性因子，包括TGF-β、HGF、PGE2和IDO，以劑量依賴性方式抑制絲裂原誘導的外周血單核細胞 (PBMC) 增殖。
- 沃爾班克等人證明了hAMSC和hAESC的PBMC免疫反應具有接觸和劑量依賴性抑制作用。
- 布拉蒂等人觀察到INF-γ誘導的hAMSC免疫調節(jié)作用依賴于活化的淋巴細胞、細胞間接觸和可溶性因子。hAMSCs顯著抑制受刺激的淋巴細胞和T細胞的增殖。
- 羅西等人證明hAMSC釋放的前列腺素對淋巴細胞具有抗增殖作用。
- 梅蘇克等人發(fā)現(xiàn)hAMSCs通過分泌吲哚胺2,3-雙加氧酶與活化的T細胞共培養(yǎng)時表現(xiàn)出免疫抑制作用。
- 莫蘭迪等人觀察到HLA-G和-E分子參與hAESC介導的T細胞增殖抑制。
此外，hADSC還對炎癥過程具有免疫調節(jié)和免疫抑制作用，包括降低炎癥細胞的活性、抑制小膠質細胞的遷移以及免疫細胞向損傷部位的募集。hADSC還表現(xiàn)出血管生成、細胞保護、抗疤痕和抗菌特性。因此，有理由相信hADSC可能是基于細胞的疾病治療的潛在細胞來源。
人羊膜干細胞療法的臨床應用價值
多項臨床前研究成功證明hADSC具有緩解多種疾病的潛力（圖3）。
01人羊膜干細胞與婦科疾病
卵巢早衰（POF）是指40歲之前因卵巢功能衰竭而導致的閉經。原發(fā)性或繼發(fā)性閉經伴隨著促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，進而出現(xiàn)潮熱、出汗、面色潮紅、性欲低下等一系列低雌激素癥狀。
研究表明，hAMSCs通過靜脈注射后將干細胞歸巢至卵巢并分泌包括FGF2、IGF-1、HGF、POF大鼠中的VEGF和VEGF。
丁等人報道hAMSCs通過分泌HGF和EGF改善卵巢自然衰老患者卵巢GC細胞的增殖并抑制其凋亡。hAMSCs通過改善卵巢局部微環(huán)境來修復POF小鼠因氧化引起的卵巢結構和功能損傷。與源自脂肪組織的MSC相比，hAMSC對環(huán)磷酰胺誘導的大鼠卵巢損傷也發(fā)揮了更高的治療功效。
賴東梅教授團隊在著名學術期刊《Molecular Therapy – Nucleic Acids》雜志上發(fā)表了《人羊膜干細胞衍生的外泌體通過轉移Micro RNA抵抗細胞凋亡來恢復卵巢功能》的文章。該最新研究進展有望為使用人羊膜干細胞干預POF打下良好的基礎。
該研究旨在鑒定源自hAEC的外泌體，并探討化療損傷卵巢的干預潛力及其分子機制。hAEC衍生的外泌體表現(xiàn)出杯形或球形形態(tài)，平均直徑為100nm，對Alix，CD63和CD9呈陽性。hAEC外泌體增加了POF模型的卵泡數(shù)量并改善了卵巢功能。
此外，hAMSCs和hAESCs在治療其他婦科疾病方面都具有相當大的潛力。
研究表明，hAMSC和hAESC均能通過旁分泌作用有效治療宮腔粘連并促進子宮內膜再生。莫特達延等人。觀察到hAESCs能夠通過挽救母體免疫異常、抑制T細胞的活化和減少活化的促炎細胞因子的產生來治療不明原因的復發(fā)性自然流產。
02人羊膜干細胞與神經系統(tǒng)疾病
人羊膜干細胞治療脊髓損傷：脊髓損傷（SCI）是由運動和感覺功能障礙引起的嚴重中樞神經系統(tǒng)疾病之一。迄今為止，尚無有效的治療方法能夠使此類神經系統(tǒng)疾病的康復令人滿意。
?？柕热藫?jù)報道，hAESCs移植物阻止了橫斷病變部位神經膠質疤痕的形成，并抑制軸突神經元的凋亡。此外，研究表明，移植的hAESCs促進軸突再生和出芽，還可以防止SCI大鼠軸突紅核的萎縮，并減輕SCI引起的機械性異常性疼痛。并且通過褪黑激素和Wnt-4的共同治療，hAESCs可能轉化為神經細胞并參與組織修復。這些研究表明 hAESC和hAMSC可能有助于SCI的恢復。
人羊膜干細胞治療阿爾茨海默病：阿爾茨海默?。ˋD）是最常見的慢性神經退行性疾病，表現(xiàn)出多種類型神經元的廣泛退化。研究表明，hAMSCs移植可能通過減輕氧化應激或破壞Aβ沉積來減輕AD小鼠的病理改變并促進記憶功能的恢復。與該研究類似，將hAESC移植到APP/PS1AD小鼠的側腦室中，增加了海馬中膽堿能神經元的數(shù)量和乙酰膽堿濃度。此外，植入hAESC的小鼠在空間記憶方面表現(xiàn)出顯著改善。微陣列分析表明hAESCs具有較高的馬鞭草素治療AD的能力。
人羊膜干細胞治療自閉癥：自閉癥譜系障礙（ASD）是一種復雜的神經發(fā)育障礙，涉及社會連通性和互動。張等人觀察到腦室內注射hAESCs通過挽救BTBR小鼠的海馬功能來緩解社交缺陷。
2019年，陸軍軍醫(yī)大學心理系發(fā)育與神經心理學教研室主任范曉棠教授及其研究生張瑞宇科研團隊在《Stem Cell Research &Therapy》（IF=4.963）發(fā)表學術論文《Human amniotic epithelial cell transplantation promotes neurogenesis and ameliorates social deficits in BTBR mice》（人羊膜上皮細胞移植對ASD模型小鼠神經發(fā)生的促進及社交功能缺陷改善的研究）。該團隊在國際上首次利用人羊膜上皮干細胞（hAESCs）移植調節(jié)改善ASD模型小鼠的神經修復及行為缺陷，研究結果令人振奮。
人羊膜干細胞治療帕金森?。?/strong>帕金森病 (PD) 是一種神經退行性疾病，其特征是黑質多巴胺神經元進行性死亡，導致紋狀體多巴胺水平下降。
近日，賽傲生物與同濟大學附屬上海東方醫(yī)院合作的國家干細胞臨床研究備案項目《人羊膜上皮干細胞（hAESCs）立體定向移植治療帕金森病》正式啟動。該項目PI由東方醫(yī)院功能神經科主任醫(yī)師吳景文教授擔任，上海賽傲生物技術有限公司提供技術支持。
臨床前研究數(shù)據(jù)證實，人羊膜上皮干細胞具有多巴胺能神經功能以及其促進內源性神經組織修復的功能，可以顯著增高紋狀體區(qū)多巴胺及其代謝產物含量。在此基礎上，本項臨床研究通過立體定向技術精準腦室內移植人羊膜上皮干細胞，探索人羊膜上皮干細胞治療帕金森病的潛能，在國際上尚屬首次。
人羊膜干細胞治療腦損傷：中風或腦中風是一種使人衰弱的疾病，其特征是出血性損傷和腦缺血癥狀。由于中風和腦中風尚無有效的治療方法，因此長期以來一直在探索基于干細胞的治療方法。
最近的研究表明，hAESCs通過在體外中風模型中表達褪黑激素受體MT1表現(xiàn)出神經分化和神經保護作用，并且全身施用hAESCs可減少中風后患者的腦部炎癥、梗塞發(fā)展和功能缺陷。大量研究表明hAMSCs及hAMSCs條件培養(yǎng)基(hAMSCs-CM)在腦缺血期具有神經保護作用。
03人羊膜干細胞與肺部疾病
研究表明，當將hAMSCs注射到白煙吸入誘導的小鼠體內時，hAMSCs可減輕肺損傷、肺纖維化、CT評分和炎癥，并且hAMSCs的霧化提供了將細胞遞送至氣道以治療肺損傷的有效方法。
特別是，支氣管肺發(fā)育不良（BPD）是一種慢性肺部疾病，主要影響需要呼吸機支持的早產兒。Malhotra等人進行了一項為期兩年的嬰兒入組研究。報道稱，低劑量同種異體hAESC對患有BPD的脆弱早產兒是安全的。
肺纖維化是某些肺部疾病的終末期變化，是指受損肺組織修復異常導致肺部瘢痕形成。Moodley等人通過將hAESC注射到博來霉素誘導的患有肺纖維化的SCID小鼠中。發(fā)現(xiàn)肺膠原含量顯著降低，表明hAESCs治療對肺纖維化有很大改善。
04人羊膜干細胞與肝臟疾病
急性肝損傷（ALI）是指各種原因引起的肝功能異常。研究表明，hAMSC 預處理通過抑制庫普弗細胞 (KC) 相關的先天免疫炎癥和KC 自噬，部分保護對乙酰氨基酚誘導的ALI，并且hAESC和hAESC-CM 顯著減少高脂肪飲食中的肝臟炎癥和纖維化。
肝纖維化是肝硬化的前兆，是一種復雜的炎癥和纖維化病癥，由慢性肝損傷和細胞外基質（ECM）合成與降解失衡引起，主要由活化的肝星狀細胞（HSCs）介導。據(jù)觀察，hAMSCs和hAMSC-CM可抑制 HSCs 的活化，進而改善肝纖維化，同時減少纖維化標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、血小板衍生生長因子（PDGF）和膠原I以及KC細胞的浸潤。hAMSC-CM能夠上調ECM降解相關基因（MMP-2、MMP-9、MMP-13和TIMP-1）和增殖相關基因cyclin-B的表達，從而抑制造血干細胞的增殖。這些發(fā)現(xiàn)為hAMSCs在肝纖維化中的保護作用提供了合理解釋。
肝硬化是成人第六大死亡原因，主要是由于肝細胞不斷損傷和肝臟傷口持續(xù)不受控制的愈合所致。hAMSCs的移植顯著減少了CCl4誘導的肝硬化的纖維化形成和進展，并通過減少肝硬化大鼠的肝臟炎癥和氧化應激來改善肝功能。此外，據(jù)報道，hAESCs能夠在小鼠肝硬化模型中分化為功能性肝細胞。
05人羊膜干細胞與腎臟疾病
在慢性腎衰竭（CKF）小鼠體內注射hAMSCs可顯著降低血清肌酐和尿素水平，并改善腎臟纖維化。
任等人等人發(fā)現(xiàn)hAESCs通過減少凋亡細胞數(shù)量、防止腎小管周圍毛細血管丟失、調節(jié)腎臟局部免疫反應來改善急性腎損傷（AKI）小鼠的死亡率和腎功能，其機制可能與減輕腎缺血再灌注損傷有關。hAESC衍生的外泌體。
劉等人證明hAESC介導的c-Rel表達減少，進而減少IL-2表達和釋放是通過刺激AKI患者來源的CD4+T細胞中的miR-101表達來實現(xiàn)的。
06人羊膜來源干細胞與皮膚病
hAMSC和hAESC通過分泌血管生成因子（IGF-1、EGF和IL-8）并增強上皮再形成和細胞結構，對糖尿病傷口具有相當大的治療潛力。我們的結果表明，hAMSCs和hAMSCs-CM通過激活 PI3K/Akt信號通路抑制細胞凋亡并促進皮膚細胞增殖，有效治療熱應激引起的皮膚損傷。hAMSC和hAESC還可以治療其他皮膚病，如疤痕疙瘩、皮膚老化和牛皮癬。
07人羊膜干細胞與糖尿病
糖尿?。―M）是一種慢性疾病，會導致多種全身并發(fā)癥。最常見的糖尿病形式是1型糖尿病和2型糖尿病，前者是由于胰島β細胞破壞導致胰島素絕對缺乏，后者是由于胰島素抵抗可能導致高血糖。
Luo等人觀察到，移植hAESCs可明顯減輕1型糖尿病小鼠的高血糖癥狀，增加血漿胰島素含量，并部分修復胰島結構，與單獨移植hAESCs組相比，hAESCs與透明質酸聯(lián)合移植表現(xiàn)出顯著的治療效果，表明透明質酸是hAESCs分化為功能性胰島素分泌細胞的有效輔助誘導劑。
08人羊膜干細胞與癌癥
盡管癌癥的治療取得了很大進展，但其發(fā)病率和死亡率仍然處于較高水平。據(jù)報道，hAMSCs能夠歸巢于腫瘤部位，通過促進細胞凋亡和抑制細胞增殖來抑制人肝癌細胞的生長。我們證明hAMSCs抗肝細胞癌的機制主要涉及其旁分泌作用，其中hAMSC衍生的DKK-3、DKK-1和IGFBP-3通過抑制Wnt顯著抑制細胞增殖并促進Hepg2細胞凋亡。
09人羊膜來源干細胞與骨骼疾病
骨關節(jié)炎 (OA) 是一種滑膜關節(jié)疾病，其特征是慢性、低度炎癥，導致軟骨破壞。 hAMSCs通過其抗氧化和抗炎作用，顯著改善膠原誘導的關節(jié)炎大鼠關節(jié)炎的嚴重程度并減少組織病理學變化。與人類脂肪干細胞相比，hAMSCs通過提高OA軟骨細胞活力、增加軟骨糖胺聚糖含量和降低 OA 滑膜巨噬細胞M1:M2 比率而具有更強的軟骨保護作用。
10人羊膜來源干細胞與心血管疾病
據(jù)報道，hAMSCs通過抑制小鼠模型中NF-κB通路的免疫反應，顯著縮小動脈粥樣硬化病變的大小，并改善左心室功能，增加毛細血管密度和血管生成細胞因子血管生成素 (Ang)-1的水平和血管內皮生長因子（VEGF-A）在心肌梗塞中的作用,?以及缺血心臟組織中心肌纖維化面積的減少。
研究表明，hAMCs通過分泌小細胞外囊泡在大鼠心肌梗塞中表現(xiàn)出抗凋亡和促血管生成功能，并且能夠分化為心肌細胞樣細胞，減少梗塞面積，改善體內心臟功能。
人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮干細胞的臨床試驗
在20世紀80年代和90年代，hAESC被移植到志愿者和患有溶酶體貯積病或鞘磷脂酶缺乏癥的患者體內。所有臨床試驗均表明hAESCs移植后未出現(xiàn)急性免疫排斥反應和腫瘤形成。此外，與真皮成纖維細胞相比，hAESC在整體組蛋白乙?；蚓€粒體點突變積累方面沒有差異，并且整體DNA甲基化降低，這表明hAESC具有遺傳穩(wěn)定性，是細胞基礎治療最安全的干細胞來源之一。
臨床上。近年來，已經進行了多項臨床試驗來評估hADSC在多種疾病中的安全性和有效性。
2018年，Lim等人進行了一項首次人體臨床試驗，評估hAESCs在BPD嬰兒中的安全性，其中將同種異體hAESCs（1×106/kg）靜脈輸注給6名早產兒，結果顯示沒有不良事件包括免疫排斥反應，表明同種異體hAESC對患有BPD的嬰兒是安全的。兩年后，他們報告稱，在hAESCs臨床試驗的2年觀察期間，1名嬰兒因無關原因在新生兒期死亡，5名幸存嬰兒均存活，未出現(xiàn)包括腫瘤形成在內的長期不良事件。
目前，I期細胞劑量遞增研究已應用于評估24名重度BPD高危早產兒靜脈輸注hAESCs的安全性和有效性。此外，還分別在代償性肝硬化患者和中風患者中評估了靜脈注射同種異體hAESC的安全性。
此外，Otagiri等人評估了hAMSC在治療難治性克羅恩病患者中的安全性和有效性。當然，這些開放標簽研究將為2期和3期臨床試驗提供可靠的數(shù)據(jù)，以實現(xiàn)開發(fā)hAESC作為不同疾病患者的治療選擇的最終目標。
2024年5月，臨床試驗數(shù)據(jù)庫（ ClinicalTrials.gov ）列出了一項“羊膜間充質干細胞”的臨床試驗，因此，迄今為止，共提出了12項同種異體hADSC應用的臨床試驗（表2）包括狼瘡性腎炎、痙攣性腦癱、骨折不愈合、角膜上皮營養(yǎng)不良、支氣管瘺、原發(fā)性卵巢功能不全、急性移植物抗宿主病、阿謝爾曼綜合征、宮腔粘連、白血病和帕金森?。▓D4）。
顯然，一旦細胞的安全性和有效性得到證實，這些臨床試驗的結果將為hADSCs的臨床應用提供證據(jù)。
人羊膜來源干細胞治療疾病的可能機制
通過回顧人羊膜來源干細胞治療上述10種主要系統(tǒng)性疾病中，我們發(fā)現(xiàn)除了向受損細胞轉分化、抑制細胞凋亡和促進再生外，hADSCs的旁分泌效應相關的免疫抑制和免疫刺激特性發(fā)揮著關鍵作用在治療各種疾病中，hADSC能夠分泌多種生長因子，包括血管調節(jié)細胞因子、抗菌肽和抗炎劑，表現(xiàn)出其血管生成、細胞保護、免疫抑制、抗炎、抗疤痕、和抗菌特性。
實際上，hADSC的旁分泌作用已被認為是基于細胞的治療的主要潛在機制，其中hADSC可能的治療機制總結于表3中。
結論與展望
人羊膜來源干細胞（hADSCs）包括hAMSCs和hAESCs，與其他干細胞相比，具有來源豐富、無倫理道德爭議、無致瘤性、低/無免疫原性等優(yōu)勢。此外，hADSC的多能特性和旁分泌作用顯著增強了其在實驗研究和臨床實踐中的應用。所有這些特性使它們成為細胞治療和再生醫(yī)學有前途的干細胞來源。
在過去的幾十年里，越來越多的證據(jù)證明了hADSC療法在體外和體內的功效。最近，世界各地正在進行大量臨床試驗，以評估hADSC在不同疾病中的安全性和有效性。顯然，一旦細胞的安全性和有效性得到證實，這些臨床試驗的結果將為hADSCs的臨床應用提供證據(jù)。毫無疑問，包括基于hADSC在內的干細胞療法將有望用于治療多種疾病。
hADSCs除旁分泌作用外，經化學誘導、生物處理、基因轉染或與其他細胞共培養(yǎng)后，在體外具有很強的轉分化能力，可分化為心肌細胞、肝細胞、表皮細胞、角膜上皮樣細胞、神經細胞和功能性胰島素分泌細胞。
表明未來在移植前體外誘導hADSCs向所需表型分化將是治療心臟病、肝損傷、糖尿病等的有效方法。此外，還應開展更廣泛的hAMSC和hAESC治療不同疾病的臨床試驗，以成功實現(xiàn)其臨床應用。
主要參考資料：Liu Q-W, Huang Q-M, Wu H-Y, Zuo G-S-L, Gu H-C, Deng K-Y, Xin H-B. Characteristics and Therapeutic Potential of Human Amnion-Derived Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(2):970. https://doi.org/10.3390/ijms22020970
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