細(xì)胞外囊泡（EV）被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)。它們?cè)陉P(guān)節(jié)內(nèi)OA進(jìn)展中的作用受到越來越多的關(guān)注。軟骨細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)OA有雙重作用。健康軟骨細(xì)胞分泌的EV可以調(diào)節(jié)M2巨噬細(xì)胞的滲透，促進(jìn)線粒體功能障礙的消除，促進(jìn)免疫恢復(fù)。然而，來自O(shè)A軟骨細(xì)胞的EVs促進(jìn)miR-449a-5p/ATG4B介導(dǎo)的自噬，抑制軟骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞凋亡，并上調(diào)巨噬細(xì)胞促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。

大量研究表明，源自間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的外泌體可以減緩OA的進(jìn)展。許多學(xué)者已經(jīng)證明，基于MSC 的OA治療主要通過EV發(fā)揮作用，傳遞包括小RNA在內(nèi)的物質(zhì)。這些物質(zhì)調(diào)節(jié)多種生物活性，例如軟骨細(xì)胞凋亡和衰老、滑膜細(xì)胞增殖以及促炎介質(zhì)的釋放。EV根據(jù)其特性和來源表現(xiàn)出特定的細(xì)胞靶向特性，并且具有生物相容性。因此，人們進(jìn)行了大量的研究工作來利用MSC-Exos來延遲OA的開發(fā)。工程技術(shù)的不斷進(jìn)步旨在開發(fā)基于MSC-Exos的藥物輸送系統(tǒng)，為OA治療的新方法鋪平道路。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的生物學(xué)特性

外泌體的結(jié)構(gòu)

外泌體的直徑約為40-100nm，構(gòu)成生物納米級(jí)球形脂質(zhì)雙層囊泡的子集，已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞類型都能分泌該囊泡。 “外泌體”一詞最初由Trams等人于1981年創(chuàng)造。指源自質(zhì)膜的囊泡。這些囊泡被認(rèn)為具有 5′-核苷酸酶活性，可能具有生理功能，并且源自不同細(xì)胞系培養(yǎng)物的擠出。由于外泌體亞型之間和內(nèi)部固有的異質(zhì)性以及重疊的特征，將外泌體與其他細(xì)胞外囊泡（EV）（例如微泡（MV）和凋亡小體（AB））區(qū)分開來可能具有挑戰(zhàn)性。值得注意的是，外泌體被發(fā)現(xiàn)封裝了豐富的生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體等。

外泌體質(zhì)膜的成分包含多種脂質(zhì)，包括己糖神經(jīng)酰胺、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂和飽和脂肪酸。

外泌體蛋白成分可大致分為兩類：常見成分，是囊泡形成和分泌不可或缺的部分；以及特定成分，與起源細(xì)胞密切相關(guān)。常見成分包括一系列在膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合（例如 Rab GTPases）、熱休克反應(yīng)（例如 HSP70、HSP90）、屬于四跨膜蛋白超家族的蛋白質(zhì)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)（例如CD63，CD81），轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）相關(guān)蛋白（如Tsg101，Alix），整合素等。 另一種是特異性成分，與它們的祖細(xì)胞密切相關(guān)，包括細(xì)胞特異性CD45和MHC-II等標(biāo)記物源自抗原呈遞細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的生物發(fā)生

EV的生物發(fā)生始于細(xì)胞內(nèi)體系統(tǒng)內(nèi)。與MV和AB不同，外泌體不是直接從質(zhì)膜釋放，而是由多泡體 (MVB) 膜向內(nèi)出芽產(chǎn)生。MVBs被稱為晚期分類內(nèi)體（LEs），在早期內(nèi)體成熟為LEs的過程中發(fā)生內(nèi)體膜內(nèi)陷，導(dǎo)致管腔內(nèi)囊泡（ILVs）的形成。該過程導(dǎo)致一些細(xì)胞質(zhì)成分被ILV吞噬并封閉，其中大部分通過MVB與質(zhì)膜融合釋放到細(xì)胞外，部分被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解。這些釋放到細(xì)胞外空間的ILV被稱為“外泌體”。 2010年，Sai Kiang Lim團(tuán)隊(duì)首次證明了間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌外泌體的治療作用。

隨后，他們證實(shí)MSC-Exos也來源于內(nèi)體，富含GM1神經(jīng)節(jié)苷脂，表現(xiàn)出高內(nèi)化活性。進(jìn)一步的研究一致表明，MSC-Exos與Alix、Tsg101、CD9、CD63 或CD81等其他細(xì)胞來源的外泌體具有相似的生物標(biāo)志物。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體作為藥物載體的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)

源自人類細(xì)胞的EV具有顯著的生物相容性、低毒性和最小的免疫原性，特別是從自體來源獲得時(shí)。尤其是 MSC-Exos在治療各種疾病方面引起了極大關(guān)注，包括骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤和自身免疫性疾?。ㄈ鏘BD、SLE和SS），并報(bào)告了罕見的嚴(yán)重不良反應(yīng)。它們的雙層脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)和納米級(jí)尺寸使它們能夠在長距離運(yùn)輸過程中保持穩(wěn)定并穿透組織屏障，包括關(guān)節(jié)腔。他們已經(jīng)證明可以有效穿越血腦屏障（BBB）和胎盤屏障等生物屏障。 CD55和CD59等EV標(biāo)記物可防止補(bǔ)體和凝血因子激活，確保其在體液中廣泛且穩(wěn)定的分布。

EVs內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各種核酸（如miRNA、mRNA、tRNA、lncRNA和rRNA），與各種藥物表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性。除了治療之外，它們還可以攜帶用于疾病診斷的造影。在許多情況下，EV介導(dǎo)的遞送構(gòu)成了細(xì)胞治療的主要機(jī)制。干細(xì)胞外泌體的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是它們能夠保留親代細(xì)胞的某些特征。同時(shí)，不同來源的MSC-Exo的特性和應(yīng)用也有所不同（表1）。

例如，免疫細(xì)胞分泌的EV具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力，研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的EV具有免疫調(diào)節(jié)和再生功能。 MSC-Exos可以通過多種途徑減少炎癥介質(zhì)的表達(dá)。此外，當(dāng)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）和軟骨細(xì)胞通過EV相互作用，促進(jìn)AD-MSCs軟骨形成，增加軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成，并抑制細(xì)胞衰老。

與細(xì)胞療法不同，干細(xì)胞外泌體面臨的倫理限制較少，免疫排斥和惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)也較低。同時(shí)，與需要嚴(yán)格條件才能維持活力的MSC相比，MSC-Exos易于維護(hù)和儲(chǔ)存。目前，許多研究人員利用人工衍生的細(xì)胞外囊泡（例如脂質(zhì)納米顆粒和脂質(zhì)體）進(jìn)行研究，因?yàn)樗鼈兛梢赃M(jìn)行精確的工程設(shè)計(jì)并提供更高的重現(xiàn)性。然而，它們?nèi)狈SC-EV固有的生物復(fù)雜性，往往攜帶單一生物活性分子，無法完全復(fù)制MSC-Exos的生物學(xué)功能。因此，與納米粒子、脂質(zhì)體和樹脂聚合物等合成藥物遞送系統(tǒng)相比，天然來源的 EV 具有卓越的治療適用性（圖1）。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的來源及制備

間充質(zhì)干細(xì)胞可以來源于多種組織，包括臍帶、脂肪組織、肌肉、牙齒組織、唾液腺、經(jīng)血等。盡管它們的起源不同，但它們具有共同的特征，例如自我更新、多譜系分化潛力和免疫調(diào)節(jié)特性。國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)定義了鑒定人類間充質(zhì)干細(xì)胞的三個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)：

• 當(dāng)維持在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞必須粘附在塑料表面。
• MSC必須表達(dá)CD105、CD73和CD90，而不表達(dá)CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-DR表面標(biāo)志物。
• MSC必須能夠在體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從各種關(guān)節(jié)組織中分離出來，包括滑膜組織、半月板、韌帶、脂肪墊和軟骨。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從各種關(guān)節(jié)組織中分離出來，包括滑膜組織、半月板、韌帶、脂肪墊和軟骨。

大多數(shù)MSC來源缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的制備程序，包括組織切碎、可選的酶消化和外植體培養(yǎng)。例如，成熟AD-MSC的培養(yǎng)通常涉及以下步驟：

首先，用PBS清洗獲得的脂肪組織，以去除多余的血液成分、局部麻醉劑或關(guān)節(jié)積液。

接下來，將組織切碎，并利用膠原酶消除纖維狀膠原。離心和過濾后，將分離的脂肪碎片引入培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞生長。這些細(xì)胞通常傳代至第3代至第5代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

不同實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、膠原酶的類型和濃度、消化時(shí)間、離心速度、持續(xù)時(shí)間和其他細(xì)節(jié)存在差異。

MSC的鑒定涉及對(duì)其表面標(biāo)記物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。不同來源的MSC的表面標(biāo)志物特征不同。 AD-MSC和BMSC均在其細(xì)胞表面表達(dá)CD13、CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、MHC I 類和 HLA-ABC。值得注意的是，AD-MSC不表達(dá)CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、DQ（MHC II 類）、CD80、CD86、CD40 或 CD154。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離鑒定

作為體內(nèi)的藥物載體，從間充質(zhì)干細(xì)胞中高效獲取純凈、安全、充足的外泌體至關(guān)重要。在實(shí)現(xiàn)高效大規(guī)模生產(chǎn)的同時(shí)，確保外泌體的純度和均質(zhì)性提出了技術(shù)挑戰(zhàn)。已采用多種方法從MSC中分離外泌體，其中差速離心是最傳統(tǒng)的方法。

目前普遍使用第3代至第6代MSC。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到80%~90%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞24~48 h。所得的細(xì)胞培養(yǎng)上清液不僅含有外泌體，還含有多種成分，如死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、微泡和凋亡小體。采用超速離心根據(jù)大小和密度分離外泌體，然后使用透射電子顯微鏡 (TEM) 進(jìn)行鑒定。差速離心可產(chǎn)生高純度但效率較低。相比之下，超濾由于設(shè)備要求較低、處理時(shí)間較短，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。尺寸排阻色譜法 (SEC) 和離子交換色譜法 (IEC) 也能產(chǎn)生高純度的外泌體。免疫分離基于針對(duì) CD9、CD63、CD81、Alix 和熱休克蛋白等表面蛋白的抗體的特異性結(jié)合，可提供高純度，但不太適合大規(guī)模生產(chǎn)。然而，其高特異性可用于分離特定的外泌體亞群，具有獨(dú)特的臨床價(jià)值。

外泌體鑒定技術(shù)已經(jīng)成熟，MSCs來源的外泌體與其他來源的外泌體在形態(tài)、分離和儲(chǔ)存條件上沒有顯著差異。外泌體鑒定的基本步驟包括形態(tài)觀察和表面標(biāo)志物鑒定。透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）是外泌體觀察的常用技術(shù)。冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM) 可提供更準(zhǔn)確的生物信息、更高的分辨率，并允許在自然水合狀態(tài)下對(duì)外泌體進(jìn)行成像，無需化學(xué)固定或染色，從而保留其自然結(jié)構(gòu)。冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）是冷凍電鏡的延伸，通過外泌體的三維成像提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療骨關(guān)節(jié)炎的研究現(xiàn)狀

間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的潛力

MSCs已被證明具有在體內(nèi)和體外分化成軟骨細(xì)胞的潛力。如前所述，OA軟骨損傷后，內(nèi)源性（來自細(xì)胞周基質(zhì)或循環(huán)）或外源性MSC被募集到損傷部位，在那里它們部分地進(jìn)行軟骨分化，促進(jìn)軟骨再生。 MSC-Exos影響MSC歸巢并促進(jìn)軟骨分化。

• 嚴(yán)康等人利用MSC-Exo傳遞circRNA-0001236，發(fā)現(xiàn)它通過miR-3677-3p/Sox9軸增強(qiáng)MSC軟骨形成，從而抑制軟骨降解。然而，內(nèi)源性MSC的數(shù)量有限，外源性MSC的歸巢能力也受到限制。僅僅依靠間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨形成會(huì)產(chǎn)生次優(yōu)的結(jié)果。雖然MSC-Exos不能直接增加MSC的數(shù)量，但它們可以通過替代途徑增強(qiáng)軟骨修復(fù)。
• 陶舒等人采用miRNA-210過表達(dá)BMSCs-Exos，通過NF-kβ途徑顯著減少LPS誘導(dǎo)的軟骨損傷。 AD-MSCs-Exos將miR-100-5p遞送至軟骨細(xì)胞，通過抑制mTOR途徑顯著增強(qiáng)細(xì)胞自噬，從而減少軟骨損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了步態(tài)的顯著改善。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎癥會(huì)加速OA的進(jìn)展，通常先于放射學(xué)表現(xiàn)，并與臨床疼痛顯著相關(guān)。因此，控制早期OA炎癥對(duì)于減緩其進(jìn)展和改善癥狀至關(guān)重要。間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)的各種免疫細(xì)胞。研究人員將AD-MSCs置于炎癥刺激TNF-α和IFN-γ下，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子基因表達(dá)增加，而促炎因子TNFA和PTGS2基因表達(dá)減少，表明AD-MSCs可以減輕炎癥通過炎癥環(huán)境中的旁分泌作用。鑒于MSC-Exosomes優(yōu)異的遞送能力和豐富的生物學(xué)功能，其作為治療OA的藥物遞送系統(tǒng)的潛力是巨大的，相關(guān)模型的研究也日益成熟（圖2）。

基于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的給藥系統(tǒng)在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用

使用MSC-Exos的無細(xì)胞療法的研究落后于MSC療法。目前，基于MSC-Exos的靶向給藥系統(tǒng)（DDS）的開發(fā)還處于早期階段，主要局限于體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。我們總結(jié)了過去5年的代表性研究（表2）。最常用的 MSC-Exo遞送涉及各種microRNA。多種microRNA已被證明可傳遞至關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨細(xì)胞或免疫細(xì)胞，通過促進(jìn)軟骨形成、抑制細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)來改善OA預(yù)后。

Liang等利用CAP標(biāo)記的外泌體，其特點(diǎn)是延長關(guān)節(jié)保留時(shí)間、有限的體內(nèi)擴(kuò)散以及將 miR-140遞送至深層軟骨區(qū)域的能力。這種遞送有效地抑制了軟骨降解酶，從而減輕了大鼠模型中骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展（圖3）。

• (A)外泌體表面工程示意圖，用于將miR-140靶向遞送至軟骨細(xì)胞以進(jìn)行 OA 治療。
• (B)用CAP-外泌體/miR-140或外泌體/miR-140制劑治療的DMM大鼠軟骨的組織學(xué)評(píng)估：軟骨組織的染色圖像。

截至2023年9月，美國國立衛(wèi)生研究院 (NIH) 數(shù)據(jù)庫中列出了238項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的注冊(cè)臨床試驗(yàn)。 MSC治療的安全性和有效性已得到很大程度上驗(yàn)證。

然而，只有一項(xiàng)與MSC-Exos相關(guān)的注冊(cè)臨床試驗(yàn)（NCT05060107），由Espinoza F于2021年10月發(fā)起。該研究旨在評(píng)估通過膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射輸送的同種異體間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞外泌體的安全性?；加休p度至中度骨關(guān)節(jié)炎癥狀的患者。他們計(jì)劃招募10名患者參加這項(xiàng)1期試驗(yàn)，隨訪期長達(dá)12個(gè)月。不過，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未公布。

結(jié)論與展望

由于對(duì)軟骨造成不可修復(fù)的損傷，目前骨關(guān)節(jié)炎的非手術(shù)治療方法并不是很有效，這是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。隨著再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，細(xì)胞療法，特別是涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞療法，得到了廣泛的研究。這些研究在各種臨床前試驗(yàn)中顯示出有希望的結(jié)果。使用MSC-Exos治療骨關(guān)節(jié)炎不僅克服了與細(xì)胞療法相關(guān)的倫理限制，而且還發(fā)揮了其作為藥物載體的潛力。

未來的研究還將解決關(guān)節(jié)腔內(nèi)持續(xù)藥物釋放的需求。該方法旨在顯著減少關(guān)節(jié)內(nèi)注射的頻率，從而降低經(jīng)濟(jì)成本并最大限度地減少副作用。

參考資料：Wen S, Huang X, Ma J, Zhao G, Ma T, Chen K, Huang G, Chen J, Shi J and Wang S (2024) Exosomes derived from MSC as drug system in osteoarthritis therapy.?Front. Bioeng. Biotechnol.?12:1331218. doi: 10.3389/fbioe.2024.1331218

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