肌萎縮性側(cè)索硬化癥 (ALS) 是一種致命的神經(jīng)退行性疾?。u凍癥），其特征是進(jìn)行性肌肉麻痹，這是由運(yùn)動皮質(zhì)腦干和脊髓中的運(yùn)動神經(jīng)元退化決定的。ALS 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，盡管大量研究表明涉及幾種改變的信號通路，例如線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥。

迄今為止，所提出的治療策略針對的是這些改變中的一個或幾個，對ALS患者的病程和存活率的影響很小。ALS發(fā)病機(jī)制中不同機(jī)制的參與強(qiáng)調(diào)了針對多個方面的治療方法的必要性。間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 可以支持運(yùn)動神經(jīng)元和周圍細(xì)胞，減少炎癥，刺激組織再生并釋放生長因子。在此基礎(chǔ)上，間充質(zhì)干細(xì)胞被提議作為治療漸凍癥的有前途的候選者。然而，由于細(xì)胞療法的缺點(diǎn)，干細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡 (EV) 的可能治療用途引起了越來越多的興趣。

意大利維羅納維羅納大學(xué)神經(jīng)科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和運(yùn)動科學(xué)系綜述總結(jié)了肌萎縮性側(cè)索硬化癥的主要病理機(jī)制和迄今為止提出的相關(guān)治療方法，重點(diǎn)是間充質(zhì)干細(xì)胞治療漸凍癥的臨床應(yīng)用。此外，討論了EV的性質(zhì)和特征及其在概括干細(xì)胞作用中的作用，闡明了這些囊泡如何以及為什么可以為肌萎縮性側(cè)索硬化癥治療提供新的機(jī)會。MSC已被提議作為治療 ALS的有前途的候選者。

肌萎縮性側(cè)索硬化癥的發(fā)病機(jī)制

鑒定ALS中運(yùn)動神經(jīng)元退化的分子機(jī)制對于理解疾病進(jìn)展和開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。盡管SOD1突變與ALS相關(guān)已有二十多年，但突變體SOD1的作用模式和隨后的神經(jīng)變性/神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制仍不清楚。在這方面已經(jīng)提出了幾個假設(shè)，并且看起來可能是機(jī)制的組合，而不是單一的機(jī)制，導(dǎo)致了ALS的神經(jīng)變性，指向多因素的發(fā)病機(jī)制（圖1)。

圖1：肌萎縮側(cè)索硬化癥 (ALS) 的發(fā)病機(jī)制。該疾病的病理生理機(jī)制似乎是多因素的，有幾種機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)變性。

• 線粒體功能障礙：線粒體損傷是許多神經(jīng)退行性疾病的共同特征。
• 谷氨酸興奮性毒性：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸前末梢合成并擴(kuò)散到突觸間隙，激活特定的突觸后受體并觸發(fā)動作電位。
• 氧化應(yīng)激：自由基或 ROS 是氧代謝的天然產(chǎn)物。當(dāng) ROS 的產(chǎn)生高于細(xì)胞去除它們的能力時，使用術(shù)語氧化應(yīng)激。這導(dǎo)致 ROS 的積累，從而對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大分子（例如蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA）造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。
• 蛋白質(zhì)聚集體：蛋白質(zhì)聚集體是許多神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)標(biāo)志，例如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥。
• 神經(jīng)絲的積累：NFs在細(xì)胞體和軸突中的積累和/或聚集，以及磷酸化NFs在細(xì)胞體中的異常定位是ALS的典型病理標(biāo)志。
• 神經(jīng)炎癥：ALS和其他神經(jīng)退行性疾病的一個共同特征是神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其特征是神經(jīng)元損傷部位的小膠質(zhì)細(xì)胞活化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和免疫細(xì)胞浸潤。

肌萎縮性側(cè)索硬化癥的治療方法

鑒于肌萎縮性側(cè)索硬化癥發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，迄今為止還沒有有效的治療方法來治愈或顯著改善患者的生活質(zhì)量。盡管如此，已經(jīng)提出了幾種治療策略來緩解漸凍癥患者的癥狀并改善其生活質(zhì)量。

藥物治療

1994年利魯唑被批準(zhǔn)用于治療漸凍癥，但它只能延長大約3個月的壽命。2017年，一種新藥依達(dá)拉奉在美國注冊。目前，利魯唑和依達(dá)拉奉(Radicava?)是唯一被FDA批準(zhǔn)的治療藥物。雖然這些藥物對生存有一定的益處，但終不能實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)或者治愈。

干細(xì)胞療法

干細(xì)胞正在成為神經(jīng)元替代和再生的一種有前途的治療方法，成為患有不同神經(jīng)退行性疾病（包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥）的患者寄予厚望和期待的源泉。干細(xì)胞作為治療方法的使用引起了極大的興趣，因?yàn)樗鼈兡軌驓w巢到受損部位，刺激組織修復(fù)和再生，并指導(dǎo)它們響應(yīng)細(xì)胞外信號進(jìn)行分化。

干細(xì)胞是一組具有自我更新能力和分化成多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。它們通常分為兩大亞型： 胚胎干細(xì)胞 (ESC)，起源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有產(chǎn)生所有三個胚層的能力；成體干細(xì)胞，可以分化成不同器官的多種細(xì)胞類型的特化細(xì)胞，通常由起源的胚層決定。在不同的干細(xì)胞類型中，最常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的是：ESC、神經(jīng)干細(xì)胞 (NSC)、MSC 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)。干細(xì)胞的最佳來源應(yīng)根據(jù)其生存、遷移至受損組織、移植和分化的生物學(xué)特性來選擇。

干細(xì)胞治療的主要目標(biāo)是細(xì)胞替代和神經(jīng)保護(hù)。第一個目標(biāo)將通過干細(xì)胞分化成與疾病有關(guān)的特定細(xì)胞亞型來實(shí)現(xiàn)，目的是替換死細(xì)胞。第二個目標(biāo)涉及基于干細(xì)胞釋放營養(yǎng)因子和去除神經(jīng)毒性分子的能力的干細(xì)胞的使用，在受損區(qū)域的微環(huán)境中提供局部支持，充當(dāng)神經(jīng)保護(hù)者。

在用于治療神經(jīng)退行性疾病的不同類型的干細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞作為有前途的候選者似乎引起了最高的興趣。MSC可以從多種胎兒和成人組織中分離出來，例如骨骼肌、胎盤、臍帶、血液和脂肪組織。脂肪組織越來越受到關(guān)注，因?yàn)樗梢詮奈g(shù)中大量獲得，從而允許脂肪來源的MSC (ASC) 的自體移植。

MSC的應(yīng)用有幾個技術(shù)優(yōu)勢。首先，它們的分離是安全和容易的，它們在體外的擴(kuò)增很簡單，而且在體外和體內(nèi)都證明它們可以分化成神經(jīng)樣、神經(jīng)膠質(zhì)樣和星形細(xì)胞樣細(xì)胞?？紤]到自體移植的可能性，MSC 對腫瘤變化的敏感性較低，并且不需要免疫抑制治療來防止排斥反應(yīng)。此外，與其他干細(xì)胞一樣，移植和遷移后，MSC會被吸引到受損區(qū)域，在那里它們會增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放。

干細(xì)胞移植治療漸凍癥的臨床試驗(yàn)

在過去的幾年中，許多基于細(xì)胞的ALS臨床試驗(yàn)都使用了MSC，并報告了MSC對ALS患者給藥的可行性、安全性和免疫學(xué)效果（表2)。

干細(xì)胞類型	移植方式/細(xì)胞數(shù)量	試用狀態(tài)和詳細(xì)信息	參考
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（14–60×106個細(xì)胞）	該方法安全可行。一些患者表現(xiàn)出神經(jīng)肌電圖改善	德達(dá)等人(2009)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	鞘內(nèi)（54.7×106±17.4×106個細(xì)胞） 靜脈內(nèi)（23.4±6×106個細(xì)胞）	該方法安全、可行，并可立即產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。I期完成，II期開放以評估不同劑量細(xì)胞的初步效果	Karussis 等人(2010年)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（15–110×106個細(xì)胞）	該方法安全可行，沒有毒性、不良事件或異常細(xì)胞生長的跡象。第一階段完成；無長期有害后果，但疾病進(jìn)展似乎并未減緩	馬志尼等人( 2010); 馬志尼等人。(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	椎管內(nèi)（138–602.87×10 6 個細(xì)胞）	該方法安全可行。尸檢后未發(fā)現(xiàn)衰退加速，脊髓運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量增加	布蘭克等人(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	腦室內(nèi)（1×106個細(xì)胞/kg）	該方法安全可行	貝克等人(2012)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	運(yùn)動皮層（2.5–7.5×105個細(xì)胞）	該方法安全可行，接受治療的患者具有更高的顯著生存率	馬丁內(nèi)斯等(2009); 馬丁內(nèi)斯等。(2012)
自體BM-MSC和神經(jīng)誘導(dǎo)的MSC	靜脈內(nèi)（42–102×106個細(xì)胞）和腰椎內(nèi)（5–9.7×102×106個細(xì)胞）	該方法安全，延緩疾病進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量	Rushkevich等人(2015年)
自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	鞘內(nèi)（1–2×106個細(xì)胞） 肌內(nèi)（1–48×106個細(xì)胞）	該方法安全可行。I期完成，II期開放以評估不同劑量細(xì)胞的初步效果	彼得魯?shù)热? 2016 年)

然而，盡管干細(xì)胞介導(dǎo)的療法代表了一種治療ALS和其他神經(jīng)退行性疾病的新方法，但迄今為止，與安慰劑治療的對照相比，尚未獲得對疾病進(jìn)展的顯著影響，并且在廣泛的臨床轉(zhuǎn)化之前需要解決關(guān)鍵問題。

首先，有必要使用標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議確定細(xì)胞向CNS的輸送，并考慮給藥途徑、細(xì)胞劑量、時間和細(xì)胞注射次數(shù)。此外，鑒于干細(xì)胞的高增殖能力，應(yīng)防止移植細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化并避免其免疫排斥。

在證明只有一小部分注射的干細(xì)胞可以到達(dá)損傷部位、移植和分化后，干細(xì)胞的有益作用是間接的并且很可能取決于它們的旁分泌活動的想法變得越來越普遍。干細(xì)胞產(chǎn)生大量含有細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質(zhì)和核酸的EV，并且可以對細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。這些觀察結(jié)果導(dǎo)致了這樣的假設(shè)，即干細(xì)胞通過分泌EV發(fā)揮其有益作用，從而增強(qiáng)受損區(qū)域釋放其內(nèi)容物的修復(fù)。因此，EV可以用作一種新型的無細(xì)胞治療方法，避免與使用細(xì)胞相關(guān)的所有風(fēng)險。

細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞間通訊在多細(xì)胞生物中起著重要作用。它可以通過細(xì)胞之間的直接接觸或通過分泌分子（例如生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子）來介導(dǎo)，從而對附近的細(xì)胞產(chǎn)生影響。在過去的幾十年中，提出了一種新的細(xì)胞通訊機(jī)制，涉及EV的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。這些囊泡代表了在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的載體，成為細(xì)胞間微環(huán)境的組成部分，并在許多生理和病理過程中發(fā)揮作用。

外泌體的治療應(yīng)用

由于外泌體和微泡可以遠(yuǎn)距離傳遞生物信息，因此越來越多的人關(guān)注這些囊泡作為病理過程抑制因子的促進(jìn)劑。由于外泌體比微泡小并且能夠穿過血腦屏障，在這里我們將重點(diǎn)關(guān)注外泌體作為神經(jīng)退行性疾病（例如肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏病）的潛在治療工具的用途。

越來越多的證據(jù)表明外泌體具有抗炎特性，可減少活化的炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，支持少突膠質(zhì)細(xì)胞并保護(hù)神經(jīng)元。此外，鼻內(nèi)注射的外泌體被迅速輸送到大腦，在那里它們可以被小膠質(zhì)細(xì)胞吸收。由于如上所述，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病的共同特征，神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制和容易到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可能性對于治療這些病癥非常重要。

使用外泌體治療神經(jīng)退行性疾病的越來越多的關(guān)注源于外泌體穿過血腦屏障的能力，血腦屏障是將腦實(shí)質(zhì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的循環(huán)血液分開的生理屏障。如前所述，目前對神經(jīng)退行性疾病的治療通常是有癥狀的，不會阻止退化過程；治愈這些病癥的主要問題是細(xì)胞和藥物無法穿過血腦屏障。最近的研究報告說，與微泡不同，外泌體可以穿過血腦屏障：假設(shè)是外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化，并且通過釋放特定的貨物，它們影響細(xì)胞連接的完整性，增加細(xì)胞之間的滲透性并允許大量進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的囊泡，在那里他們可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用（圖2)。

結(jié)論和未來展望

科學(xué)界對間充質(zhì)干細(xì)胞作為神經(jīng)退行性疾病的潛在治療方法的興趣是由于它們能夠遷移到受損組織、分化并促進(jìn)修復(fù)過程。除了這些特點(diǎn)，ASC也很容易獲得，可用于自體移植，避免可能的細(xì)胞排斥反應(yīng)。這些特性使ASC 成為基于細(xì)胞替代和細(xì)胞分化的細(xì)胞療法的候選者。由于ASC的有益作用可能是由于旁分泌活動而不是它們的植入，因此科學(xué)界已將重點(diǎn)從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EV，由于其內(nèi)容，EV可以重現(xiàn)ASC效應(yīng)，并可能為用于治療ALS的非細(xì)胞療法。這種創(chuàng)新療法很容易轉(zhuǎn)移到ALS患者身上，因?yàn)镋V將從自體ASC中獲得，并且會保留其來源的免疫特性，避免免疫原性反應(yīng)。

鑒于EV可能應(yīng)用于ALS，囊泡需要穿過BBB才能到達(dá)損傷部位，并且在EV中，外泌體具有所需的特性。為了測試外泌體在ALS中的作用，我們最近證明，在ALS的體外模型中施用外泌體在氧化損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，支持外泌體可以概括和改善干細(xì)胞療法的神經(jīng)保護(hù)作用的觀點(diǎn)。

主要參考資料：

[1]:Bonafede R, Mariotti R. ALS Pathogenesis and Therapeutic Approaches: The Role of Mesenchymal Stem Cells and Extracellular Vesicles. Front Cell Neurosci. 2017 Mar 21;11:80. doi: 10.3389/fncel.2017.00080. PMID: 28377696; PMCID: PMC5359305.

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